بررسی تاثیر شرایط القا و بیان تحت کنترل پروموتر T7 در تولیدIGF-1 نوترکیب در باکتری Escherichia coli

Abstract

مقدمه: IGF-1 فاکتور رشد مهمی است که با ارتقا عمل هورمون رشد هیپوفیزی، رشد طولی و آنابولیک بدن انسان را واسطه گری میکند. IGF-1 نوترکیب انسانی با نام ژنریک Mecasermin برای درمان طولانی مدت اختلال رشد در کودکان با فقدان IGF-1 به کار می رود. به منظور استفاده از پروتئین نوترکیب انسانی IGF-1 برای مقاصد درمانی نیازمند تولید این پروتئین در مقیاس بالا هستیم. به منظور تعیین شرایط تولید ایده آل پروتئین ها بایستی فاکتورهای متعددی از جمله شرایط بیان و القا، پروموتر، سویه باکتریایی و محلولیت پروتئین را مورد بررسی قرار داد. هدف: در این پروژه پایان نامه، بر آنیم پروموتر trc با پروموتر قوی تر T7 جایگزین کنیم و تأثیر شرایط القا و بیان بر تولید IGF-1 نوترکیب در باکتری اشرشیاکلی بسنجیم. روش کار: پس از تغییر پروموتر در کاست بیانی ، کلونینگ و بیان ژن سنتتیک IGF-1 را در سویه Shuffle E. coli انجام شد. به منظور یافتن بهترین محیط کشت، باکتری ها در محیط های SB ، TB 2 ، xYT ، SOB و SOC کشت داده شدند. آزمایش ابتدایی برای به دست آوردن بینش اولیه در مورد اثر غلظت IPTG انجام شد.به منظور طراحی آزمایش مناسب برای تعیین غلظت مطلوب IPTG و زمان پس از القاء از روش سطح پاسخ با استفاده از طرح مرکب مرکزی بهره جستیم. یافته ها: بیشترین میزان زیست توده و rIGF-1 در باکتریهای رشد یافته در محیط SOB و SOC مشاهده شد. افزایش غلظت IPTG از 4.0 میلی مولار به 4.0 میلی مولار و 1.2 میلی مولار منجر به میزان ببیشتری از بیان پروتئین نوترکیب شد. در طراحی مرکب مرکزی، نقاط ستاره ای که 6 ساعت القا و غلظت 1 میلی مولار IPTG بودند بیشترین بیان را در پی داشتند. نتیجه گیری: در محیط کشت SOC ، غلظت متوسط IPTG و زمان القا تاثیر معنی داری بر بیان rIGF-1 دارند.