Genome Engineering of CHO Cell Line for Knock out of Caspase 7 Gene and Evaluation of its Effects on Viability and Apoptosis

Abstract

سلول های Ovary Hamster Chinese میزبان سیستم های بیانی برای تولید پروتئین های نوترکیب مانند فراورده های داویی-درمانی در مقیاس وسیع هستند. اگرچه هنوز محدودیت های در کارایی بیان و کیفیت پروتئین های تولیدی وجود دارد. در این مطالعه با هدف بهبود عملکرد بیوسنتز سلول های K1-CHO مسیر آپوپتوز وابسته به کاسپازها با خاموش سازی ژن کاسپاز 7 هدف قرار می گیرد. روش: برای هدف قرار دادن ژن کاسپاز 7 ،روش ساده ای با بکارگیری ترکیب independent-homology Cas9/CRISPR integration targeted( HITI CRISPR )و تکنولوژی CRISPR one-in-all پایه ریزی شد. بعد از انتخاب سلول هایی که نقص کاسپاز 7 دارند با PCR با استفاده از تکنیک وسترن بالت خاموش سازی هموزیگوت ژن کاسپاز 7 در سلول CHO تایید شد. در ادامه اثر خاموش ساز کاسپاز 7 روی تکثیر سلولی، زنده مانی و آپوپتوز سلولی با استفاده از تست MTT و فلوسیتومتری انجام شد. یافته ها: in knock/knockout همزمان با ورود لوکوس بیانی EGFP در ژنوم CHO ،انتخاب کلونی را تسهیل می کند به طوری که 57 ٪کلون های جداسازی شده EGFP مثبت بودند. تست تکثیر سلولی نشان داد که نقص کاسپاز 7 تکثیر سلولی را تا 30 ٪کاهش می دهد که به نظر می رسد به دلیل دخیل بودن کاسپاز 7 در تکثیر سلول های CHO است. یافته های MTT نشان می دهد خاموش سازی کاسپاز 7 در مواجهه با سدیم بوتیرات بر روی زنده مانی سلول CHO مهندسی شدده در مقایسه با سلول وحشی اثر سوء دارد. همچنین، تست آپوپتوز با استفاده از V Annexin نشان داد که سلول های مهندسی شده بیشتر مستعد آپوپتوز هستند. نتیجه گیری: یافته های این مطالعه پیشنهاد می کند که کاسپاز 7 می تواند نقش اساسی در چرخه سلولی باز می کند و نقص در این ژن می تواند در تکثیر سلول اختالل ایجاد کند.