مهندسی آنزیم اکریپلاسمین جهت کاهش فعالیت پروتئولیتیک و اتولیتیک و بیان واریانت های جهش یافته در Pichia pastoris

Abstract

اکریپلاسمین (Jetrea)، در درمان بیماری چسبندگی ويتروماکولار (VMA) که یکی از عوامل شایع نابینایی در سنین بالا می باشد، مورد استفاده قرار می گیرد. در pH فیزیولوژیک، اکریپلاسمین دارای فعالیت اتولیتیک و پروتئولیتیک بالاست که این فعالیت ها به ترتیب موجب کاهش نیمه عمر آنزیم و آسیب به بافت شبکیه می شود. هدف: هدف مطالعه حاضر تلاش در جهت رفع این دو مشکل عمده (فعالیت های پروتئولیتیک و اتولیتیک بالا) در آنزیم اکریپلاسمین بوده است. روش کار و مواد: ابتدا توسط روش جهش زایی هدفمند، واریانت های موتانت آنزیم با هدف کاهش فعالیت اتولیتیک و پروتئولیتیک طراحی شد. ارزیابی موتاسیونی واریانت های مختلف اکریپلاسمین با استفاده از نرم افزار های بیوانفورماتیکی صورت پذیرفت. پس از ارزیابی های بیوانفورماتیکی واریانت های وحشی و موتانت (پروتئولیتیک، اتولیتیک و اتولیتیک/پروتئولیتیک)، سه واریانت موتانت توسط تكنيك SOE-PCR ساخته شد. کلونینگ، بیان و تخلیص واریانت ها در پیکیا پاستوریس صورت گرفت. سپس فرم غیر فعال تمامی واریانت ها توسط آنزیم یوروکیناز به فرم فعال آن ها تبدیل و در حضور سوبسترای S-2403 فعالیت هیدرولازی تمامی واریانت ها تایید گردید. واریانت های موتانت و وحشی پروتئین با استفاده از روش های آزمایشگاهی مقایسه شدند. یافته ها: ارزیابی های آزمایشگاهی نشان داد كه تبدیل آلانین 59 به ترئونین نقش مهمی در كاهش فعالیت پروتئولیتیك و تبدیل لیزین 156 به گلوتامیک اسید به طور قابل توجهی بر عملکرد اتولیتیک تأثیر می گذارد. فعالیت های پروتئولیتیک و اتولیتیک در واریانت اتولیتیک/پروتئولیتیک نسبت به سایر واریانت ها کاهش بیشتری را نشان داد. نتایج آنالیزهای آماری نشان داد که تفاوت در میزان فعالیت های پروتئولیتیک و اتولیتیک در بین واریانت های وحشی و موتانت معنی دار می باشد (P-value<0.05). نتیجه گیری: نتایج نشان داد که واریانت های موتانت اکریپلاسمین ابزارهای ارزشمندی جهت بررسی روش های درمانی، به منظور درمان چسبندگی ویتروماکولار می باشند.