جداسازي نواحی متغییر آنتی بادی تک زنجیری عليه Hsp70 از كتابخانه آنتي بادي فاژ

Abstract

مقدمه: پروتئین Hsp70 یک پروتئین شوک حرارتی است که در سلول های نرمال بیان نشده یا اینکه بیان بسیار اندکی دارد. در حالیکه در سرطان های مختلف، دارای سه فرم سیتوپلاسمی، غشایی و بیرون سلولی بوده و در مراحل مختلف تومور زایی شرکت می کند. هدف: تولید، خالص سازی و تعیین خصوصیات یک آنتی¬بادی تک زنجیره¬ای علیه Hsp70. روش‌ها: با بررسی ساختمان سه بعدی Hsp70 ناحیه ای 12 آمینواسیدی از آن بعنوان هدف تعیین شد. این پپتید بصورت سنتتیک تهیه و جهت غربال کتابخانه¬ی فاژی قطعات آنتی بادی انسانی مورد استفاده قرار گرفت. پس از چهار دور biopanning، اختصاصیت کلون¬های به دست آمده با استفاده از پلی کلونال و منوکلونال فاژ الایزا تعیین گردید. صحت DNA کلون¬های مثبت، توسط PCR و توالی یابی بررسی گردید. پس از بیان کلون منتخب در میزبان بیانی و خالص‌سازی آن توسط کروماتوگرافی تمایلی، عملکرد قطعه آنتی‌بادی بدست آمده توسط دات بلات و ایمونوفلورسنس میکروسکوپی ارزیابی شده و پارمترهای کینیتیکی اتصال آن به پپتید هدف توسط تکنیک SPR اندازه‌گیری گردید. نتایج: طبق نتایجPCR ، 8 کلونی از 14 کلونی، هر دو ژن VH و VL را داشتند. اما آنالیز توالی DNAها نشان داد که فقط 5 کلونی توالی قابل قبول دارند. کلون منتخب (G6A) به دلیل داشتن ژن VH کوتاهتر، یک قطعه آنتی بادی حدود 4/17کیلو دالتون را کُد می کرد. بیان قطعه آنتی‌بادی G6A، در محدوده‌ی وزنی مورد انتظار و خلوص بالای آن پس از کروماتوگرافی تمایلی، توسط SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد. دات بلات و ایمونوفلورسنس میکروسکوپی اختصاصیت و عملکرد را تائید کردند. پارامتر KD نیز توسط SPR حدود M 7-10 × 22/7 محاسبه گردید. نتیجه‌گیری: در این مطالعه یک قطعه آنتی¬بادی انسانی ضد Hsp70، پس از تولید، خالص شده و عملکرد آن به اثبات رسید که می تواند بستر مناسبی جهت توسعه¬ی عوامل درمانی و تشخیصی علیه سرطان¬های بیان کننده ی Hsp70 فراهم کند.