بررسی اثر ملاتونین بر فرایند میتوفاژی و پیشرفت سرطان در ساختارهای توموروئید تشکیل شده از سرطان کلورکتال
Abstract
سرطان کلورکتال (CRC) سومین سرطان شایع در جهان است و آمار رو به رشدی را نشان می‌دهد. با توجه به اثربخشی محدود درمان‌های فعلی، علیرغم اینکه نرخ بقا افزایش یافته است، شیوع این بیماری هم‌چنان بالا بوده و نیاز مبرمی به رویکردهای درمانی جدید و مؤثر احساس می‌شود. استفاده از سیستم های کشت سه بعدی در مقایسه با سیستم های کشت دوبعدی می تواند اطلاعات ارزشمندی را درخصوص سازو کارهای مولکولی مقاومت سلول های سرطانی و کارایی سیستم های درمانی در اختیار محققین و متخصصین بالینی قرار دهد. رویکردهای مبتنی بر حذف اندامک های درون سلولی از جمله میتوکندری از جمله مکانیسم‌هایی است که امروزه در درمان سرطان ها به واسطه ی پتانسیل بالای آن مورد توجه قرار گرفته است. ملاتونین به عنوان یک هورمون آنتی‌اکسیدان قوی، با توجه به خصوصیات ضد التهابی و ضد استرسی و تومورکشی، ممکن است نقش مؤثری در کاهش ریسک و پیشگیری از تومورهای کلورکتال ایفا کند. مطالعات اخیر نقش دوگانه این هورمون را در مواجه با سلول های سرطانی نشان داده است. در این مطالعه نقش کشندگی هورمون ملاتونین در سیستم سه بعدی تومورئید کلورکتال از طریق فرآیند میتوفاژی مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روش‌ها: در این تحقیق، سلول‌های آدنوکارسینوم کلورکتال انسانی (HT-29)، سلول های آندوتلیال(HUVECs) و رده فیبروبلاستی (HFFF2) برای ایجاد توموروئیدهای سرطانی به ترتیب نسبت 2:1:1 مورد استفاده قرار گرفتند. توموروئیدها با غلظت های مختلف ملاتونین (005/.، 02/.، 04/.، 06/.، 08/.، 2/.، 4/.، 6/.، 8/.، 4 و 10 میلی مول) به مدت 72 ساعت تیمار شدند. بقاء سلول ها در ساختار تومورئید بر اساس میزان رهایش لاکتات دهیدروژناز، و رنگ آمیزی هماتوکسیلن-ائوزین برای بررسی یکپارچگی ساختار پارانشیم توموروئیدها انجام گرفت. در پایان، با استفاده از آزمون qPCR، و وسترن بلات بیان ژن‌ها و پروتئین های مرتبط با میتوفاژی و فیوژن میتوکندری PINK1، OPTN، MFN1 و MFN2 بررسی شد.
یافته‌ها: یافته های حاصل از بررسی میکروسکوپ نوری نشان دهنده ساختار یکپارچه توموروئیدها 72 ساعت بعد از القاء ساختار تومورئید است. در این ساختار ناحیه مرکزی نکروتیک (تیره) توسط سلول های پیرامونی در حال تکثیر احاطه شده است. سلول های کناری (پیرامونی) توموروئیدها به صورت کشیده و فشرده بر روی سطح توموروئیدها قرار گرفته اند. بر اساس نتایج به دست امده، ملاتونین اثرات تومورکشی وابسته به دز از خود نشان داد. به طوری که در دزهای 005/. تا 8/. میلی مول هیچ گونه افزایش معنی داری در مقادیر آنزیم لاکتات دهیدروژناز مشاهده نشد. ولی در گروههای تیمار شده با دزهای 4 و 10 میلی مول میزان این آنزیم به طور معنی داری در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافت (p<0.05). در دزهای بالاتر ساختارتومورئیدها متلاشی و سلول ها به صورت منفرد در کف پلیت های کشت مشاهده شدند. در رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، میزان سلول های نکروتیک در دو گروه 4 و 10 به شدت افزایش یافته و توده توموروئیدها کاهش قابل توجهی از نظر اندازه نشان داد. از طرفی، انالیز qPCR حاکی از افزایش سطوح بیانی وابسته به دوز PINK1، OPTN، MFN1 و MFN2 به ترتیب در دوزهای ۴ و ۱۰ میلی مولار ملاتونین بودند. همچنین، نتایج مربوط به انالیز وسترن بلات، حاکی از کاهش سطوح پروتئینی مارکرهای همجوشی میتوکندری MFN1 و MFN2 و افزایش سطوح پروتئینی مارکرهای میتوفاژی PINK1 و OPTN بود.