اثر اگزوزوم های بارگیری شده با استرادیول با منشا سلول های مغز استخوان بر مدل ضایعه استخوانی
Abstract
تحت ضربه و فشارهای شدید و با کاهش توانایی استخوان در تحمل فشارهای وارده، شکستگی ایجاد می شود که این موارد در سالخوردگان و افراد با بیماری های زمینه ای بیشتر دیده می شود. در بسیاری از موارد روش های درمانی متداول، نتایج مطلوبی دارند ولی در 10 درصد موارد، عوارضی از جمله عفونت، بدجوش و حتی عدم جوش خوردگی رخ می دهد که سبب مشکلات فیزیکی دائمی می شوند. امروزه تحقیقات جهت رفع این مشکلات در زمینه داربست های زیستی، سلول ها و مشتقات آنها ادامه دارد. داربست های هیدروژلی بستر مناسبی را برای رشد سلول ها فراهم می آورند. اگزوزوم ها به عنوان کیسه های غشایی مشتق از سلول و حاوی ماکرومولکول های تنظیم گر سلولی نتایج چشمگیری در مطالعات مختلف از جمله فیلد استخوان از خود نشان داده اند. همچنین استرادیول از دسته هورمون های استروژنی است که دارای اثرات محرک ساخت استخوانی، مهار بازجذب استخوانی و اثرات ضد التهابی است. از همین رو در این مطالعه از داربست هیدروژلی بارگیری شده با اگزوزوم های سلول های مغز استخوان بارگیری شده با استرادیول جهت ترمیم مدل ضایعه استخوانی استفاده شد.
مواد و روش‌ها: استخراج اگزوزوم از سلول های مغز استخوان خرگوش از نژاد نیوزیلندی و با روش اولتراسانتریفیوژ انجام شد. مورفولوژی و اندازه اگزوزوم ها با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و تفرق دینامیکی نور (DLS) تجزیه و تحلیل شد. توسط آنالیز وسترن بلات، پروتئین‌های CD63 و CD9 به عنوان نشانگرهای اگزوزوم مورد بررسی قرار گرفتند. جهت بارگیری استرادیول در اگزوزوم ها از روش آنکوباسیون استفاده شد و تایید بارگیری دارویی با روش HPLC و TEM صورت گرفت. ارزیابی رئولوژیکی، ضریب فشار و زیست پذیری داربست هیدروژلی با روش هایFTIR ، TGAو SEM سنجیده شد. جهت ایجاد مدل های ضایعه استخوانی با ابعاد 5/0×5/0، در استخوان تیبیا خرگوش های از نژاد نیوزیلندی، جراحی با استفاده از بور دندانپزشکی انجام شد. این مطالعه در 5 گروه حیوانی متفاوت انجام شده که داربست، اگزوزوم ها و استرادیول در این پنج گروه به شکل متمایز و توامان در ناحیه نقص استخوانی قرار داده شدند و سپس محل جراحی کاملا بسته شد. پس از دو ماه حیوانات قربانی شدند و استخوان های تیبیای خرگوش ها برداشته شدند و جهت ارزیابی ترمیم صورت گرفته تحت تست های Real Time-PCR، ایمونوهیستوشیمی (IHC)، رنگ آمیزی H&E و تصویربرداری با Micro-CT قرار گرفتند.
نتایج: اگزوزوم های استخراجی دارای مورفولوژی گرد و دو لایه با روش TEM بودند. از لحاظ اندازه و پتانسیل زتا در محدوده 120-30 نانومتر و بار الکتریکی تقریبی mv 10- قرار داشتند. میزان بارگیری استرادیول در اگزوزوم ها با روش HPLC، ng 77/59 بود. تست های سنجش کیفیت داربست شامل: TGA و سمیت ساختاری نشان از مقاومت حرارتی مناسب و عدم سمیت و زیست پذیری بالای هیدروژل بود. پس از طی دوره درمان، نتایج تست های Real Time-PCR، IHC، رنگ آمیزی بافتی H&E و تصویر برداری Micro-CT نشان دادند، بیان فاکتورهای استخوانی، تولید بافت استخوانی تازه در گروه آخر (داربست-اگزوزوم-استرادیول) به صورت معنی دار (P<0.0001) بالاتر از سایر گروه های مطالعه است.