ارزیابی اثر ضد توموری هاگ باکتری Clostridium novyi-NT بر سرطان دهانه رحم در مدل موشی

Abstract

مقدمه: تومور‌های جامد بیش از 80 درصد از سرطان‌ها را تشکیل می دهند. روش‌های رایج برای درمان این بیماری عبارتند از رادیوتراپی، شیمی درمانی و... اما این روش‌ها معایبی دارند و 50 % از بیماران سرطانی با این روش‌ها درمان نمی شوند. با وجود ساخت واکسن های ضد ویروس پاپیلومای انسانی، سرطان دهانه رحم همچنان یک بیماری شایع در بین زنان به ویژه در کشورهای در حال توسعه محسوب می‌شود. وجود ریزمحیط های هیپوکسیک باعث شکست روش های درمانی سنتی می شود. هر تومور سرطانی شامل سه منطقه می‌باشد: منطقه‌ نکروز شده، منطقه بدون اکسیژن ,منطقه با اکسیژن زیاد. در میان این سه منطقه، منطقه‌ی هیپوکسیک نسبت به درمان‌های سیستمیک سرطان مقاومت بیشتری نشان می‌دهد. در مقابل همین منطقه بدون اکسیژن یک ناحیه مناسب برای رشد باکتری‌های بی هوازی می‌باشد. محققین دانشگاه جانز هاپکینز در اوایل قرن 21 ام ایده درمان سرطان با باکتری زنده را اجرایی کردند و 26 باکتری بی هوازی را به جهت توانایی در ساکن شدن و منتشر شدن در مدل زنوگراف سرطان کلون انسانی بررسی کردند. بر اساس موارد گفته شده باکتری Clostridium novyi به عنوان یک گزینه مناسب در نظر گرفته شد. این باکتری گرم مثبت بوده و دارای توانایی تولید اندوسپور، بی هوازی اجباری و موجود در خاک می باشد. این باکتری پاتوژن است و به طور گسترده‌ای در انسان و حیوان بیماری ایجاد می‌کند. بر این اساس پیشنهاد می‌شود از شکل غیر سمی این باکتری‌ها جهت هدف گرفتن منطقه هیپوکسیک سرطان استفاده شود.هدف: ایجاد سویه غیر سمی Clostridium novyi و بررسی اثرات ضد توموری آن در مدل موشی سرطان دهانه رحم ایجاد شده با رده سلولی TC-1 مواد و روش: در ابتدا بهترین محیط کشت برای رشد سویه وحشی Clostridium novyi تعیین شد. در ادامه با فرایند های گرمایی ژن آلفا توکسین Clostridium novyi حذف شد. سپس به روش کلنی PCR و استخراج پلاسمید از حذف فاژ حمل کننده توکسین نوع آلفا اطمینان حاصل شد. پیش از ایجاد و تزریق اسپور غیر سمی، آزمایش های مربوط به غیر سمی بودن اسپورهای حاصل در محیط درون تنی موشی مورد سنجش قرار گرفت. پس از اطمینان از تکمیل فاز ایجاد اسپورهای غیر سمی Clostridium novyi-NT، رده سلولی TC-1 که قادر به بیان انکوپروتئین های HPV-16 E6/7 است، به صورت زیر جلدی به موش های ماده 6 تا 8 هفته ای C57/BL6 پیوند زده شد. موش های حامل تومور به طور تصادفی به 4 گروه تقسیم شدند و پس از انتخاب گروه کنترل، با روش های مختلف تحت درمان قرار گرفتند. گروه 1- کنترل بدون درمان (1/0 میلی لیتر PBS داخل تومور استریل). گروه 2- سیس پلاتین داخل صفاقی (10 میلی گرم/کیلوگرم). گروه 3- دریافت 107 اسپور Clostridium novyi-NT به صورت سیستمیک از طریق ورید دمی. گروه 4- موش های توموری که 107 اسپور Clostridium novyi-NT به صورت داخل توموری دریافت کردند. 20 روز پس از شروع درمان، موش‌ها قربانی شدند و بافت‌های تومور جدا شدند. حجم تومورها به منظور مقایسه اثرات ضد توموری اسپورها اندازه گیری شد. با استفاده از رنگ آمیزی گرم (Gram staining) جوانه زنی اسپورها در بافت توموری ثابت شد. با روش های مشاهده میکروسکوپی نواحی نکروزه شده تومور پس از درمان مشخص شد. به منظور روشن شدن مکانیسم اثر درمانی اسپورها، مقدار ROS با روش الایزا و میزان بیان پروتئین های سیتوکروم c، کاسپاز 3، Bax، Bcl-2، HIF-1α و VEGF با تکنیک وسترن بلات اندازه گیری شد. نتایج: بهترین محیط کشت برای رشد باکتری محیط‌های غنی F و NP هستند. با بررسی‌های مولکولی و بالینی اثبات شد که Clostridium novyi-NT فاژ خود را که حاوی سم آلفا است از دست داده است. نتایج ما به وضوح نشان داد که تزریق هاگ Clostridium novyi-NT (به صورت داخل تومور یا داخل وریدی) باعث پسرفت تومورهای دهانه رحم موش می شود. جوانه زنی هاگ با القای تولید ROS تام درون سلولی، آزادسازی سیتوکروم c و آسیب رساندن به میتوکندری، آپوپتوز داخلی را در سلول های سرطانی القا می کند. همچنین میزان بیان پروتئین های طرفدار هایپوکسی HIF-1α و VEGF در این شیوه درمانی کاهش پیدا می کند. نتیجه گیری: پژوهش ما نشان داد که توسعه یک روش درمانی مبتنی بر Clostridium novyi-NT علیه سرطان دهانه رحم ناشی شده از HPV می تواند بر محدودیت های درمانی ناشی از وجود نواحی هیپوکسیک تومور غلبه کند. از طرفی به نظر می رسد فسفولیپاز سی که در هنگام جوانه زن توسط اسپور های Clostridium novyi-NT در نواحی هیپوکسیک تومور ترشح می شود، نقش مهمی در پسرفت بافت توموری در کنار تحریک سیستم ایمنی میزبان اجرا می کند.