تولید و اصلاح آنزیم ال-گلوتامیناز نوترکیب با استفاده از پلیمر پلی اتیلن گلیکول و بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن

Abstract

ال-گلوتامیناز آنزیمی است که ال-گلوتامین را هیدرولیز می کند که در صورت نیاز، میتواند به عنوان جایگزین برای آنزیم اسپارژیناز در درمان سرطان ALL مورد استفاده قرار گیرد. هدف: هدف از این مطالعه تولید و شناسایی ال-گلوتامیناز نوترکیب از باکتری های بومی و اصلاح آن با استفاده از پلیمر پلی اتیلن گلیکول و بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن و سپس ارزیابی اثر ضد لوسمی آن است. روش کار: ژن گلوتامیناز (YLM) در ناقل های بیانی کلون شد. آنزیم درسیستم بیانی بیان و استخراج شد. انحلال اینکلوژن بادی با استفاده از روش اوره انجام شد و سپس با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی تخلیص شد. در ادامه به منظور بهینه سازی خصوصیات آنزیم، اتصال آن به پلیمر پلی اتیلن گلیکول انجام شد وخصوصیات فیزیکوشیمیایی آن اعم از پارامتر های سینتیکی، پایداری و سمیت سلولی آن سنجش و با فرم غیرپگیله مقایسه شد. نتایج: داده های حاصل از ژل الکتروفورز، نشان دهنده صحت انجام PCR، هضم و ligation در تمامی مراحل کلونینگ و سابکلونیگ بوده و آنالیز توالی های تعیین شده هم تایید کننده این موضوع بودند. کشت های باکتریال هم تایید کننده زنده ماندن صحت انجام Transformation بود. نتایج حاصل از SDS-PAGE صحت انجام القای بیان و استخراج پروتئین کلون شده در وکتور های بیانی را تایید کرد. سپس اتصال Peg به آنزیم نوترکیب با استفاده از نتایج حاصل از ظاهرسازی ژل های SDS-PAGE و همچنین نتایج حاصل از اسپکتوفتومتری مورد بررسی قرار گرفت و اتصال آن تایید شد. نتایج تست MTT نشان دهنده حساسیت سلولهای Jurkat به دوز های مختلف آنزیم پگیله شده و آزاد تعیین و مقایسه گردید. داده های حاصل از بررسی آپوپتوز نیز محاسبه و مقایسه شد. بحث: در حال حاضر PEGylation مواد نوترکیب با رویکرد اصلاح ویژگی های فیزیکوشیمیایی و درمانی مانند ایمنی زایی و نیمه عمر کوتاه به عنوان روشی موثر در تحقیقات شمرده میشود.