ارزیابی بیان ترشحی اینترفرون آلفاa2 انسانی در E.coli با استفاده از توالی سیگنال پپتید انتخابی از مطالعات in silico

Abstract

مقدمه بیان ترشحی پروتئین های نوترکیب دارای مزایای بسیار زیادی است که توجه دانشمندان را برای تولید ترشحی پروتئین های هترولوگ برانگیخته است. یک عنصر حیاتی در ترشح موثر پروتئین های نوترکیب، سیگنال پپتید می باشد. اینترفرون آلفاa 2 همچنین یک سایتوکین چند منظوره است که برای بیماران مبتلا به HCV، سارکوم کاپوزی، ملانوم و لوسمی میلوژن مزمن (CML) استفاده می شود. هدف این پژوهش با هدف ارزیابی بیوانفورماتیکی کتابخانه ای شامل 71 سیگنال پپتید مختلف برای شناسایی کارآمدترین سیگنال پپتید برای تولید ترشحی اینترفرون آلفاa 2 در E. coli انجام شد. روش کار ابتدا از “SignalP 4.1" برای پیش بینی سیگنال پپتیدها و همچنین محل برش آنها استفاده شد. بر این اساس، از میان کتابخانه ای متشکل از 71 سیگنال شناخته شده، پنج سیگنال پپتید شامل OSPA1_BORBU، CDGT_BACS2، CPLR_DESHA، SPA_STAAU و LPP_E. coli از تجزیه و تحلیل بیشتر بعلت مشکلات برش حذف شدند. ویژگی‌های فیزیکی-شیمیایی مختلف سیگنال پپتیدها با پتانسیل تأثیرگذاری بر ترشح پروتئین توسط سرورهای ProtParam و SOL pro مورد بررسی قرار گرفت. همچنین، جایگاههای قرارگیری درون سلولی و مرتب سازی سیگنال پپتیدها بر اساس مسیرهای ترشحی توسط برنامه های ProtcompB وPRED-TAT مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج این مطالعه نشان داد که سیگنال پپتیدهای Chaperone sfmC (SFMC_ECOLI)، (ASR_ECOLI)، (DEGP_ECOLI) و (DSBA_ECOLI) می توانند به عنوان سیگنال پپتیدهای کارآمد برای بیان ترشحی اینترفرون آلفاa 2در نظر گرفته شوند. با توجه به اسکورهای بدست آمده، سیگنال پپتید SFMC برای ارزیابی عملی انتخاب شد، جهت افزودن سیگنال پپتید SFMC به توالی اینترفرون الفا، توالی کد کننده اینترفرون آلفاa 2 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی که شامل دو پرایمر فوروارد که هر یک شامل بخشی از توالی سیگنال پپتید بودند و یک پرایمر ریورز با PCR تکثیر شد. سپس آمپلیکون در وکتور بیانی pET26b کلون شده، به سویهcoli BL21 .E ترانسفورم شده و میزان بیان پروتئین در دماهای مختلف و غلظتهای مختلفIPTG با روش SDS-PAGE آنالیز شد. نتایج الکتروفورز محصول PCR یک قطعه700 جفت بازی را نشان داد که با اندازه مورد انتظار IFN-alpha-2a+ SFMC_ECOLI مطابقت داشت. تعیین توالی قطعه کلون شده هویت محصول را به عنوان اینترفرون آلفاa 2 تایید کرد. بیان پروتئین نوترکیب انسانی اینترفرون آلفاa 2 در E. coli BL21 سطوح بالایی از پروتئین نوترکیب را تولید کرد که به عنوان یک باند متراکم در تجزیه و تحلیل SDS-PAGE ظاهر شد. آنالیز بیان در دما و غلظت های پایین القاگر نشان داد که بخش قابل توجهی از پروتئین نوترکیب در فضای پری پلاسمیک بیان می شود.

نتیجه گیری در این مطالعه جهت بیان ترشحی پروتئین اینترفرون آلفا a2 سیگنال پپتیدهای مختلف با استفاده از مطالعات بیوانفورماتیکی مورد بررسی قرار گرفته و موثرترین سیگنال پپتید انتخاب شد بررسی بیان پروتئین هدف با سیگنال پپتیید انتخاب شده نشان داد که سیگنال پپتید SfmC می تواند بصورت موثری پروتئین هدف را به پریپلاسم منتقل نموده و محلولیت آنرا افزایش دهد.