طراحی و تولید و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی آنزیم نوترکیب ال آسپاراژیناز جدید بر اساس توالی آنزیم آسپاراژیناز جدا شده از E. coli

Abstract

مقدمه: ال-آسپارژیناز (ASNase)(L-asparagine aminohydrolase, E.C.3.5.1.1) آنزیمی است که برای ساخت داروهای ضد نئوپلاستیک استفاده می شود. استفاده دارویی از ال-آسپارژیناز به ‌دلیل واکنش‌های آلرژیک و انواع سمیت‌ها بدون خطر نیست و نیاز به تولید ASNaseهای bio-better وجود دارد. تکنیک‌های متنوعی از جمله تکامل هدایت‌شده، جهش‌های نقطه‌ای تصادفی، گسترش زنجیره، و جهش‌زایی جهت‌دار مکانی، برای بهبود پایداری پروتئین استفاده می‌شوند. اهداف: 1. طراحی آنزیم جدید ال-آسپارژیناز با خواص بیودارویی بهبود یافته 2. تولید آنزیم طراحی‌شده و ارزیابی فعالیت آن. مواد و روش ها: 21 جهش مهم ال-آسپاراژیناز و اهمیت عملکردی مرتبط با آنها از مقالات جمع‌آوری شد. جهش‌های شناسایی‌شده برای تولید فهرستی از جهش‌های ال-آسپاراژیناز با تمام ترکیب‌های ممکن تا ۴ جهش استفاده‌شد. .پایداری مدل‌های ساختاری سه‌بعدی ال-آسپارژیناز با تمام 7546 جهش پیشنهادی به صورت کامپیوتری محاسبه‌شد. امیدوارکننده‌ترین جهش برای طراحی یک ساختار ژنتیکی مناسب برای بیان و خالص‌سازی آنزیم در سیستم بیان باکتریایی انتخاب شد. ساختار ژنتیکی طراحی‌شده خریداری، تکثیر و به میزبان بیانی باکتریایی منتقل شد. در نهایت با استفاده از روش‌های طیف‌سنجی فعالیت آنزیم نوترکیب مورد ارزبایی قرار گرفت. یافته‌ها: مطالعه محاسباتی پیش‌بینی کرد که جهش مضاعف Y176F/S241C E. coli L-asparaginase ممکن است پایداری تاخوردگی آن را افزایش دهد. توالی DNA طراحی شده برای ASNase برای تولید آنزیم نوترکیب به دو سویه مختلف E. coli ترنسفورم شدند. سطح بیان ASNase در هر دو سویه از نظر کیفی برابر است، اما به نظر می رسد آنزیم تولیدشده در سویه PlysS حاوی توالی سیگنال pelB است، در حالی که آنزیم‌های بیان شده در سویه Origami عمدتاً بدون پپتید سیگنال هستند. سنجش عملکرد نشان داد که ASNase نوترکیب طراحی‌شده فعال است. نتیجه‌گیری: آنزیم ASNase جدید با جهش دوگانه با خواص آنزیمی بهبود‌یافته طراحی و تولید شد . بر اساس یافته های این مطالعه، آنزیم شناسایی شده می تواند در آزمایشات بیشتری مورد استفاده قرار گیرد و پتانسیل استفاده از آن برای کاربردهای دارویی و صنعتی تایید شود.