مقایسه میزان شیوع تیپ های CRISPR/Cas در انتروکوکوس فکالیسهای جدا شده از عفونت‌‌های بالینی بیمارستان‌‌های آموزشی و درمانی امام رضا (ع) و کودکان تبریز، ارتباط آنها با مقاومت آنتی‌‌بیوتیکی، ویرولانس و ارزیابی اثر سیستم CRISPR/Cas بر مقاومت آنتی بیوتیکی به ونکومایسین و آمینوگلیکوزیدها

Abstract

هدف از این مطالعه، بررسی فنوتیپی و ژنوتیپی فاکتورهای ویرولانس و مقاومت آنتی‌‌بیوتیکی و ارتباط آنها با CRISPR-Cas در ایزوله‌‌های بالینی انتروکوکوس فکالیس و حذف ژن‌‌های vanA و aac(6ʹ)-aph(2ʺ) توسط ژن cas9 می‌‌باشد. مواد و روش‌‌ها: تعداد 88 ایزوله انتروکوکوس فکالیس از نمونه‌‌های بیمارستانی و 73 ایزوله از کانال ریشه دندانی جمع‌‌آوری گردید. فاکتورهای ویرولانس و مقاومت آنتی‌‌بیوتیکی آنها به روشهای فنوتیپی و ژنوتیپی بررسی شد. حضور لوکوس‌‌های CRISPR آنها نیز به روش ژنوتیپی بررسی گردید. همچنین، پلاسمید cas9 حامل gRNA هدف vanA و aac(6ʹ)-aph(2ʺ) به ایزوله‌‌های مقاوم به ونکومایسین و جنتامیسین ترانسفورم گردید. یافته‌‌ها: تشکیل بیوفیلم و فعالیت ژلاتینازی و همولیزی بترتیب در 8/93%، 2/29% و 2/19% از ایزوله‌‌ها شناسایی شد. بیشترین فراوانی ژن‌‌های ویرولانس مربوط به ace و efaA و کمترین آنها مربوط به cylA بود. بیشتر ایزوله‌‌ها به تتراسایکلین و اریترومایسین مقاوم بودند و کمترین مقاومت مربوط به لینزولید و تیکوپلانین بود. بیشترین حضور ژن‌‌های مقاومت آنتی بیوتیکی مربوط به aadE و tetM و کمترین حضور مربوط به vanB بود که در هیچ یک از ایزوله‌‌ها یافت نشد. حضور CRISPR1-cas، CRISPR2 و CRISPR3-cas بترتیب در 13%، 3/55 % و 4/17% از ایزوله‌‌ها برآورد شد که ارتباط معناداری معکوس آنها با ژنهای esp و gelE یافت گردید. همچنین، ارتباط معناداری معکوس بین CRISPR1-cas و مقاومت به سیپروفلوکساسین و ریفامپین، بین CRISPR2 و ونکومایسین و فسفومایسین و بین CRISPR3-cas و اریترومایسین، تتراسایکلین و جنتامیسین وجود داشت. بعلاوه، ارتباط معناداری معکوس بین CRISPR1-cas و tetM، بین CRISPR2 و aadE و aacA-aphD و بین CRISPR3-cas و tetM، ermB، aadE، ant(6) و aacA-aphD وجود داشت. مقادیر حداقل غلظت مهاری برای ونکومایسین از µg/mL 256 و بیشتر از 512 بصورت معناداری به µg/mL 2 بعد از ترانسفورماسیون پلاسمید pCas9-vanA به ایزوله‌‌های انتروکوکوس فکالیس کاهش یافته بودند. همچنین، حداقل غلظت مهاری برای جنتامیسین از بیشتر از µg/mL 512 به µg/mL1 بعد از ترانسفورماسیون پلاسمید pCas9-aac(6’)+aph(2”) به ایزوله انتروکوکوس فکالیس کاهش یافته بود. در روش cloning PCR برای تشخیص ژن‌‌های vanA و aac(6ʹ)-aph(2ʺ) برای کلون‌‌های ترانسفورم شده با pCas9-vanA و کلون‌‌های ترانسفورم شده با pCas9-aac(6ʹ)-aph(2ʺ) باندی یافت نگردید.