تهيه پروتئاز تثبيت شده برروي نانوپارتيكل دندريمري اصلاح شده پلي آميدوآمين وبررسي فعاليت وپايداري آن

Abstract

دندریمرها بعنوان گروه جدیدی از پلیمر های پیشرفته غیر خطی، اخیرا به دلیل خصوصیات ساختاری و فیزیکو شیمیایی بی نظیرشان، مورد توجه ویژه محققین قرار گرفته و کاربردهای متعددی در حوزه های مختلف تحقیقاتی به عنوان حامل های دارویی، پایه تثبیت آنزیم و تشکیل بیو کونژوگه های پلیمر- پروتئین پیدا کرده اند. از بین دندریمرها، دندریمر پلی آمیدو آمین، از مهمترین وپر کاربرد ترین آنها می باشد که دارای گروه عاملی آمین انتهایی با قابلیت اتصال به دیگر مولکولهای فعال بیو لوژیکی است. ساختار این دندریمرها متشکل از هسته، بخش های شاخه ای و سطوح پر ازگرو ه های عاملی است. هدف گروه های انتهایی آمینی دندریمر پلی آمیدو آمین به دلیل داشتن بارمثبت در pHفیزیولوژیک، اثر سمی برروی سلولها دارند و برای کاستن از اثر سمی آنها می توان سطح این دندریمرها را اصلاح کرد طوریکه در pH فیزیولوژیک بارخنثی به خود بگیرند. روش موجود برای تبدیل گروه های عاملی آمینی به گرو ه های عاملی آلدهیدی، واکنش گروه های آمینی با معرف گلوتار الدهید است. گلوتار الدهید دارای دو ایراد اساسی است یکی سمیت آن ودیگری امکان کراس لینک آن یا به عبارتی اتصال از چندین محل به حالت رندوم است. لذا هدف از این تحقیق یافتن معرفی بود که از یک طرف واکنش پذیر بوده واز طرف دیگر محافظت شده باشد و همچنین اثر سمی روی سلولها نداشته یا اثر سمی آن کمتر باشد. آمینو استالدهید به دلیل داشتن ویژه گی ها ی ذکر شده کاندید خوبی برای اهداف فوق است. هدف دیگر از این مطالعه، تثبیت آنزیم تریپسین برروی دندریمر فوق و بهینه کردن خصو صیات عملکردی آنزیم از جمله فعالیت و پایداری آن در شرایط مختلف از دما، pH ودر حضور حلال های آلی است. روش کار و مواد با استفاده از اتیلن دی آمین به عنوان هسته مرکزی با چهار محل واکنش پذیر و افزودن متیل آکریلات در حلال متانول واکنش شروع شده ودندریمر با چهار گروه عاملی انتهایی استری سنتز شد (واکنش افزایشی مایکل 1و2) سپس برای پرهیز از انجام واکنش های جانبی اتیلن دی آمین بصورت مازاد افزوده شد و باانجام واکنش آمیداسیون، دندریمر با انتهای عاملی آمینی سنتز شد. واکنشهای فوق بصورت متوالی تکرار شده و در نهایت دندریمر نسل 5/1 با 16 عامل انتهایی استری بد ست آمد. این یکی از دندریمر های هدف بود که معرف ویژه آمینو استالدهید دی متیل استال بر روی آن اضافه شده ودندریمر با انتهای استالی حاصل شد که طی هیدرولیز با تری فلوئورو استیک اسید به دندریمر هدف ما یعنی نسل دو دندریمر پلی آمیدو آلدهید تبدیل شد. این دندریمر به عنوان پایه برای تثبیت آنزیم تریپسین با متد کووالانسی مورداستفاده قرار گرفت ودرنهایت فعالیت، اثر دما، اثر pH وتاثیر حضور حلال های آلی بر روی آنزیم آزاد وتثبیت شده مورد مطالعه قرار گرفته و با یکدیگر مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج: نتایج این بررسی نشان می دهد که سمیت دندریمر با انتهای الدهیدی بطور معنی داری کمتر از سمیت دندریمر با انتهای آمینی است. راندمان تثبیت چدود 68% بوده و فعالیت آنزیم تثبیت شده به دلیل تغییرات جزیی در کنفور ماسیون جایگاه فعال آنزیم کمتر از آنزیم آزاد بوده است که البته این نتیجه دور از انتظار نبود و افزایش تعداد مصرف آنزیم در حالت تثبیت شده کاملا این کاهش فعالیت را جبران می کند. همچنین آنزیم تثبیت شده در دماهای بالاتر فعالیت بیشتری نسبت به آنزیم آزاد نشان داد که نشان از بهبود عملکرد این آنزیم در این مورد است. بررسی اثر pH نشان داد که محدوده فعالیت بهینه آنزیم تثبیت شده نسبت به آنزیم آزاد بیشتر شده است. ودر نهایت در بررسی اثر حلال های آلی، نشان داده شد که برخی از حلال ها باعث افزایش و برخی از حلال ها باعث کاهش فعالیت آنزیم می شوند. نتیجه گیری به نظر می رسد که دندر یمرهای پلی آمیدو آلدهید پایه های خوبی برای تثبیت آنزیم بوده وباعث بهبود عملکرد آن می شود. همچنین سمیت این نوع از دندریمرهای به طور معنی داری کمتر از دیگر دندریمر ها بوده و می توانند بعنوان حامل در دارو رسانی، ژن درمانی و غیره بکار روند.