بررسی پروفایل متیلاسیون پروموتر ژن ها و MicroRNA های اختصاصی قلب و میزان بیان آنزیم های DNA متیل ترانسفراز (DNMT) در مسیر تمایز سلولهای قلبی از سلولهای C2C12 بنیادی جنینی موش

Abstract

در سال های اخیر، تحقیقات درباره ی اپی ژنتیک و نقش آن در به وجود آمدن بیماری ها مورد توجه قرار گرفته است. کشف اهمیت جنبه های اپی ژنتیکی مانند متیلاسیون DNA، microRNA ها و نیز نقش بیان ژن CDK9 در تکامل و تمایز سلول های قلبی- عضلانی می تواند در سلول درمانی مدنظر قرار گیرد. کینازهای وابسته به سیکلین (CDK) از جمله Cdk9 با تمایز قلبی- عضلانی در ارتباط هستند. شواهد روزافزون نشان می دهد که بیان بیش از حد Cdk9 می تواند اپی ژنوم را تنظیم کند. ما در این مطالعه برای اولین بار، تاثیر افزایش بیان ژن CDK9 بر پروفایل متیلاسیون ژن های خاص قلبی- عضلانی و پروموتور ژن ها و میکروRNA ها و همچنین سطح بیان ژن های DNMT در طی تمایز قلبی- عضلانی سلول های بنیادی جنینی موش C2C12را بررسی نمودیم.

روش بررسی: برای مطالعه تاثیر بیان بیش از حد ژن Cdk9 بر تغییرات متیلاسیون ژنوم و ژن های درگیر در متیلاسیون DNA، مطالعه بر روي رده سلولی C2C12 انجام گرفت. در این مطالعه رده سلولی C2C12 وحشی (کنترل) و سلول های ترانسفکت شده با Cdk9 در محیط کشت مربوطه کشت و سپس در مرحله subconfluency سلول ها تمایز داده شدند. RNA و DNA از آنها استخراج گردید و برای مطالعه تغییر بیان و بررسی متیلاسیون پروموتور ژن ها مورد استفاده قرار گرفت. RNA تام (Total RNA) از سلول های کشت داده شده با استفاده از محلول Trizol استخراج شده و پس از تبدیل به cDNA، سطح بیان ژنهای DNMT1، DNMT3A و DNMT3B به روش Real time RT-PCR تعیین شد. از mRNA مربوط به ژنGAPDH بعنوان کنترل استاندارد داخلی استفاده گردید. بعد از استخراج DNA از سلول ها تغییر کلی متیلاسیون DNA (global genome methylation)تحت اثر تمایز با استفاده از کیت مخصوص Methyl Flash kit اندازه گیری شد. تغییر متیلاسیون پروموتر MicroRNA ها و ژن های درگیر در تمایز (myoD, myogenin) پس از انجام واکنش DNA با سدیم بی سولفیت به روش Methylation specific PCR (MS-PCR) تعیین شد. DNA تغییر یافته سپس با استفاده از پرایمرهای طراحی شده برای ژن ها و microRNA های مذکور استخراج شد. سپس برای پروموتر ژنهای مورد نظر با استفاده از تکنیک PCR تکثیر شده و پس از الکتروفورز محصولات PCR و بر روی ژل آگارز و مشاهده قطعات مورد نظر توسط gel doc وضعیت متیلاسیون ژن ها بررسی گردید. در نهایت بعد از استخراج DNA از سلول های C2C12 قبل و بعد از تمایز با استفاده از کیت مخصوص Methyl Flash kit میزان درصد سیتوزین های متیله در کل ژنوم با استفاده از کیت مخصوص و با استفاده از روش ELISA اندازه گیری گردید. نتیجه گیری: نتایج ما نشان داد که بیان بیش از حد Cdk9 در سلول های ترانسفکت شده با پلاسمید Cdk9 می تواند متیلاسیون DNA پروموتر میکروRNAها از جمله miR-1 و miR-133 و همچنین متیلاسیون عمومی DNA و بیان ژن DNMT در سلول های میوبلاست C2C12 را افزایش دهد. بطور کلی، نتایج مطالعه ما بینش جدیدی در مورد مکانیسم های اپی ژنتیکی ارائه داد که Cdk9 باعث تغییر متیلاسیون پروموتر ژنهای درگیر در تمایز میوبلاست ها و تعدیل متیلاسیون عمومی DNA سلول های میوبلاست در طی تمایز می شود.