بررسی آلودگی DNA باکتریایی در داروی نوترکیبGCSF با روش Real-Time PCR

Abstract

مقدمه: در جریان تولید داروهای نوترکیب در میزبان بیولوژیک، قطعاتی از اسید نوکلئیک میزبان می تواند وارد محصول شود. نهادهای قانونی برای میزان اسید نوکلئیک میزبان در محصول نهایی حد مجازی را تعیین نموده اند. تعیین مقدار این DNA جزء الزامات کنترل کیفیت فراورده های بیولوژیک می باشد. هدف: هدف از این مطالعه توسعه یک روش حساس برای بررسی آلودگی DNA میزبان باکتریایی در مدل داروی نوترکیبGCSF با روش Real-Time PCR می باشد. روش کار: ابتدا بعد از طراحی پرایمر های اختصاصی و استخراج DNA از مدل میزبان باکتریایی (E.coli BL21)؛ رقت های متوالی از آن تهیه گردید، و در ادامه بهینه سازی واکنش Real-Time PCR به منظور رسم منحنی استاندارد صورت گرفت. سپس کارایی واکنش PCR در شناسایی آلودگی DNA در نمونه های Spike شده، بصورت مستقیم و غیر مستقیم پس از استخراج DNA از آن به کمک منحنی استاندارد، تعیین گردید. جهت تحکیم نتایج، الکتروفورز ژل آگارز بر روی نمونه ها صورت گرفت. یافته¬ها: واکنش PCR بهینه شده ، فاقد هر گونه محصول غیر اختصاصی و پرایمر دایمر بود. همچنین واکنش PCR توانمندی لازم در شناسایی و تعیین مقدار DNA را با مقادیر LOD 0.09 pg/μl و LOQ 0.27 pg/μl ؛ را نشان داد. همچنین نتایج حاصل از ژل الکتروفورز و Real-Time PCR نشان داد که تکثیر DNA در حضور دارو نیز صورت گرفته است. نتیجه¬گیری: این نتایج نشان داد که تکنیک Real-Time PCR توسعه یافته در این مطالعه، می تواند به عنوان یک روش کاربردی در فرایند تشخیص ناخالصی های DNA با منشاء E. Coli در فراورده های دارویی نوترکیب تولید شده در آن میزبان همانند GCSF به کار برده شود.