شناسایی کلستریدیوم در فرآورده های گیاهی به روش PCR

Abstract

مقدمه: مطابق گایدلاین WHO سویه های کلستریدیوم بدلیل بیماری زایی نباید در فرآورده-های گیاهی دارویی حضور داشته باشند. هدف: بررسی میزان آلودگی گیاهان دارویی جمع آوری شده از عطاری های شهر تبریز با سویه های کلستریدیوم و مقایسه نتایج بدست آمده از دو روش استاندارد WHO و PCR روی گیاهان خاکشیر و آویشن میباشد. مواد و روش ها: در اين مطالعه تاييد فنوتيپي سوش استاندارد کلستریدیوم با استفاده از محيط کشتSPS Agar و Cooked meat وTSC و رنگ آميزي گرم صورت گرفت. طراحي واکنش زنجيره اي پليمراز با پرايمر هاي CACAGYAGGTTGCAAAACTAATG:Forward، Revearse: GCTGTTCCTTTTTGAGAGTTAGC ويژه جنس کلستریدیوم صورت گرفت .جهت تعيين LOD50 ، رقت هاي متوالي از باکتري خالص و همچنين آزمون ماتریکس گیاهی آلوده شده به باکتري خالص تهيه گرديد و هرکدام از اين رقت ها در محيط کشت غني شده Cooked meat با 3 تکرار کشت گرديد. سپس از اين محيط به طور موازي هم به محيط کشت اختصاصي کلستریدیوم انتقال گرديد و همچنین پس از استخراج DNA وارد واکنش PCR شد، مقایسه دو روش با مقایسه مقادیر LOD50 بدست آمده از آنها صورت گرفت. یافته ها: کلستریدیوم در واسطه Cooked meat بوی سوختگی ارگانیک ایجاد میکند و گوشت را هضم نمیکند. کلستریدیوم پرفریجنس در آگار گوسفندی فیبرم زدایی شده 5 درصد کلونی های بزرگ، مدور، محدب نیمه شفاف، دارای لبه‌های صاف ایجاد کرده، باعث همولیز دوگانه شد. اسپور های بیضوی مرکزی با باسیل متورم شده در بخش انتهایی تشکیل شد. واکنش PCR برای این ژن با پرایمرهای اختصاصی آن انجام شد، نهایتا تک باند 204 جفت بازی حاصل گردید. LOD50 بدست آمده از دو روش کشت مستقیم کلستریدیوم و روش مولکولی نیز، 11CFU بدست آمد. نتیجه گیری: مقایسه LOD50 های دو روش نشان میدهد که این روش می تواند با حساسیت مشابه روش کشت، باکتری را شناسایی نموده، می تواند یک جایگزین مناسب برای روش کشت باشد.