بررسی سرکوب بیان ژن HMGB1 در سلولهای بنیادی ژله وارتون با سیستم CRISPR\CAS9

Abstract

مقدمه و هدف اپیدرمولایزیس بولوزا (EB) به طور معمول یک بیماری پوستی هتروژن است که حدودا 500000 نفر در جهان به آن مبتلا هستند . در حال حاضر درمان قطعی و کاملی برای EB وجود ندارد ولی استراتژی های درمانی جدید که شامل درمان براساس پروتئین، فیبروبلاست و پیوند مغز استخوان می باشد ، آینده ی خوبی را پیش بینی می کنند. اخیرا ژن تراپی در درمان این بیماری های پوستی با استفاده از سلول های اپیدرم اصلاح شده مورد توجه قرار گرفته است. HMGB1 پروتئینی است که توسط سلول های ایمنی مانند ماکروفاژ ها و مونوسیت ها و دندریتیک سل ها ترشح می شود. این مارکر در مایع تاول های بیماری اپیدرمولایزیس بولوزا به مقدار فراوانی شناسایی شده و نشان داده شده است که میزان این مارکر در بیماری های اتوایمیون دیگر نیز افزایش می یابد. در این مطالعه هدف بررسی کاهش بیان ژن HMGB1 به عنوان یک مارکر شناخته شده در بروز و شدت بیماری اپیدرمولایزیس بولوزا در محیط آزمایشگاه با سرکوب بیان ژن با سیستم CRISPR/CAS9 بود. مواد و روش این سلول ها از ذخیره ی سلولی دانشکده ی علوم نوین تهیه شد و بعد از طی مراحل آزمایشگاهی از نظر میزان بیان ژن HMGB1 با گروه کنترل مقایسه شد. داده های آماری با نرم افزار17 SPSS و P<0.05 بررسی شد. وکتور حاوی ژن های HMGB1 و CRISPR-CAS9 به همراه مارکر GFP و ژن های ویروس لنتی طراحی و سنتز شد. بعد از تأیید وکتور طراحی شده از سلول های HECK239 برای Pakaging استفاده شد. در نهایت محیط حاوی ویروس در سه زمان 24-48-72 ساعت جمع آوری شد و بر روی سلول های بنیادی ژله وارتون ریخته شد. مراحل PCR بعد از یک هفته انجام گرفت و نتایج بدست آمده با استفاده از نرم افزار SPSS17 مورد بررسی آماری قرار گرفت. نتایج بر اساس نتایج این طرح میزان بیان HMGB1 و سلول های بنیادی ژله وارتون در حالت عادی ( گروه شاهد ) 0.02 و گروه سرکوب شده (گروه مورد) این ژن توسط مسیر کریسپر 0.005 بود که میزان 4 برابر کاهش پیدا کرده بود. این ارقام در بررسی آماری با P<0.05 معنا دار گزارش شد بحث بر اساس این مطالعه ی آزمایشگاهی به نظر میرسد سرکوب بیان ژن HMGB1 از طریق سیستم کریسپر فرایندی موفق بوده و می توان در مطالعات حیوانی مورد بررسی بیشتر قرار بگیرد.