بررسی میل ترکیبی و برهمکنش دمین آنتی بادی I44 با فاکتور نکروز دهنده توموری آلفای انسانی

Abstract

مقدمه فاکتور نکروزدهنده توموری انسانی (TNF-) نقشی کلیدی در پاتوژنز بیماری های خودایمنی ایفا می کند. داروهای ضد TNF رایج بدلیل برخی عوارض جانبی محدودیت هایی دارند؛ بنابراین شناسایی داروهای جدید با عوارض کمتر ضروری به نظر می رسد. هدف هدف در این پروژه تخلیص دمین آنتی بادی I44 شناسایی شده و ارزیابی های بیولوژیک به منظور تعیین تمایل آنتی بادی به TNF- می باشد که می تواند در بهینه سازی و طراحی آنتی بادی های قوی تر متصل شونده به TNF- بکار رود. روش ها ژن کدکننده آنتی بادی I44 به باکتری E.coli Origami وارد و بصورت سیستم متصل شده به دنباله ی هیستیدین در شرایط بهینه بیان گردید و توسط ستون نیکل- سفارز تخلیص انجام شد. روند بیان و تخلیص پروتئین با کمک SDS-PAGE بررسی و تکنیک وسترن بلات جهت تأیید بیان آن بکار گرفته شد. با کمک الایزا میزان اتصال آنتی بادی I44 به TNF- مطالعه و با استفاده از پایگاه های اطلاعاتی پروتئین، آنتی بادی I44 مدل بندی و مطالعات داکینگ مولکولی بین TNF- و دمین آنتی بادی I44 انجام شد.یافته ها در این پژوهش، آنتی بادی I44 در سیستم بیانی باکتری بطور موفقیت آمیزی بیان و تخلیص گردید. نتایج نشانگر یک باند در ناحیه 17 کیلودالتون روی ژل SDS-PAGE بود. آنالیز وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی ضد دنباله هیستیدینی، تولید آن را تأیید کرد. آنتی بادی I44 تخلیص شده، تمایل مناسبی نسبت به TNF- نشان داد (Mµ 18/ 5Kd=). مطالعات داکینگ مولکولی نشانگر برهم کنش های هیدروفوبیک و هیدروژنی بین آنتی بادی I44 و TNF- بود.نتیجه گیری در پژوهش حاضر، دمین آنتی بادی I44 ضد TNF- بیان و خالص سازی شد و با کمک تکنیک های مختلفی تخلیص آن تأیید گردید و تمایل مناسبی نسبت به TNF- نشان داد. این یافته ها می تواند در طراحی و توسعه داروهای جدید علیه TNF- مورد استفاده قرار گیرد., Introduction Tumor necrosis factor alpha (TNF-) plays a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. The current FDA-approved anti-TNF- therapeutics has many limitations due to some adverse effects. Therefore, identification of new therapeutics with low adverse effects is inevitable.Aims In the current investigation, I44 domain antibody identified from phage display technology was purified and its affinity towards TNF- was investigated.Methods For expression of I44 domain antibody, the pIT2 vector containing gene of I44 antibody was used and transformed into E.coli Origami (DE3). The protein was expressed based on 6×His-tagged fusion system under optimized condition. The expressed 6×His fusion protein was applied to nickel sepharose affinity column. Protein expression and purification was monitored by SDS-PAGE analysis. Western blotting technique was used to identify the expression of recombinant protein. Using ELISA experiment the binding ability of the identified I44 domain antibody to TNF- was investigated. Docking studies was conducted in order to predict the interactions between TNF- and I44 antibody.Results In the current study, the anti-TNF- I44 domain antibody was successfully expressed in bacterial expression system with further purification by affinity chromatography. The result showed a band around 17 kDa on SDS-PAGE representing the expression of recombinant protein. Western blotting analysis using anti 6×His tag antibody confirmed the production of I44 antibody. The purified I44 antibody showed appropriate affinity towards TNF- in ELISA experiment. Molecular docking studies showd Hidrogen bonds & hydrophobic interactions between the domain antibody & TNF-.Conclusions In the present work, the anti-TNF- I44 domain antibody was expressed and purified and its production was verified using different techniques. The identified domain antibody showed suitable affinity towards TNF- (5.18µM). The findings in the current work can be useful in designing and developing of anti-TNF- therapeutics.Keywords TNF-; Domain antibody; ELISA; Western blotting; protein purification