بررسی میل ترکیبی و برهمکنش دمین آنتی بادی I49 با فاکتور نکروز دهنده توموری آلفای انسانی

Abstract

مقدمه بیماریهای خودایمنی کیفیت زندگی تعداد زیادی از مردم در سراسر جهان را تحت تأثیر قرار داده اند. فاکتور نکروز دهنده توموری آلفای انسانی (TNF-) نقش مهمی در ایجاد بیماریهای خودایمنی ایفا می کند. عوارض جانبی داروهای موجود علیه این بیماریها محدودیت های زیادی ایجاد کرده است. بنابراین شناسایی داروهای جدید با عوارض جانبی کمتر اهمیت زیادی دارد.هدف در مطالعات قبلی دومین آنتی بادی I49 عرضه شده بر روی فاژ خصوصیات اتصالی مناسبی به TNF- از خود نشان داده است. هدف از این مطالعه بیان و تخلیص دمین آنتی بادیI49 و بررسی میزان تمایل آن به TNF- می باشد.روش کار ژن کدکننده DNAِ آنتی بادی I49 به باکتری E. coli Origami انتقال داده شد. سپس بصورت پروتئین نوترکیب با دنباله His×6 بیان گردید. کروماتوگرافی تمایلی برای تخلیص این پروتئین نوترکیب توسط ستون تمایلی نیکل- سفارز انجام پذیرفت. بیان و تخلیص توسط تست SDS-PAGE بررسی و تکنیک وسترن بلاتینگ جهت شناسایی پروتئین تخلیص شده به کار گرفته شد. توانایی اتصال I49 به TNF- با تست ELISA ارزیابی و مطالعات داکینگ مولکولی بین TNF- و آنتی بادی I49 انجام شد.یافته ها در این مطالعه آنتی بادی I49 بطور موفقیت آمیز بیان و تخلیص گردید. باند موجود در حوالی 17 کیلودالتون در ژل SDS-PAGE نشانگر پروتئین مورد نظر است. تست وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی ضد دنباله 6×His نتایج تولید آن را تأیید کرد. دمین آنتی بادی خالص شده تمایل مناسبی نسبت به TNF- در تست ELISA نشان داد (Mµ 56/2Kd=). مطالعات انطباق مولکولی نشانگر برهم کنش های هیدروفوبیک و هیدروژنی بین دمین آنتی بادی I49 و TNF- بود.نتیجه گیری دمین آنتی بادی تخلیص شده در این مطالعه افق جدیدی را در طراحی داروهای جدید علیه TNF- در درمان بیماریهای خودایمنی فراهم می آورد. , Background Autoimmune diseases are the complications that adversely affect people’s life all around the world. Tumor necrosis factor alpha (TNF-) plays a key role in the pathogenesis of autoimmune diseases. The clinical use of marketed anti-TNF- therapeutics is associated with adverse effects. Therefore, identification of new therapeutics with minimum adverse effects is of great importance in autoimmune-related diseases.Aims The aim of this work was expression and purification of an anti-TNF- I49 domain antibody identified from phage display technology. Material and Methods The pIT2 vector including the DNA sequence of I49 antibody was transformed into E.coli Origami (DE3), followed by over-expression as 6×His tag protein. Affinity chromatography of recombinant protein was conducted using nickel sepharose affinity column. The expression and purification was monitored by SDS-PAGE analysis. Western blotting technique was also used for identification of purified domain antibody. The binding ability of the identified domain antibody to TNF- was investigated using ELISA experiment. Docking studies were performed for prediction of interactions of I49 and TNF-.Result I49 domain antibody was successfully expressed and affinity purified. The band around 17 kDa on SDS-PAGE represents the protein of interest. Western blotting analysis using anti 6×His tag antibody confirmed the production of I49 antibody. The purified I49 antibody showed appropriate affinity towards TNF- in ELISA experiment (2.56 µM).The result of docking study showed several hydrophobic and hydrogen bond interactions between I49 domain antibody and TNF-.Conclusion The findings in the current work can pave the way for designing and developing of novel therapeutics applicable in inflammatory diseases.Keywords TNF-; Domain antibody; SDS-PAGE; ELISA; Western blot