پگیلاسیون آلبومین سرم انسانی و بررسی تاثیر ساختار خطی و شاخه دار پلیمر mPEG-Maleimide با وزن ملکولی های یکسان بر شعاع هیدرودینامیک آلبومین پگیله شده و پروفایل بازداری آن در جداسازی با روش کرماتوگرافی تعویض یونی

Abstract

مقدمه آلبومین سرم انسانی پروتئین عمده سرم می باشد و مسئول 80% فشار اسمزی کلوئیدی پلاسما است. کاربردهای بالینی آن شامل درمان هیپوآلبومینمیا و هیپوولمیا می باشد. افزایش نفوذپذیری مویرگی در شرایط حاد بیماری موجب نشت آلبومین از مویرگ ها و در ادامه موجب هیپوولمیا و ادم میان بافتی میشود، از این رو نیاز به تجویز پی در پی آلبومین برای حفظ غلظت خونی موردنظر به وجود می آید. افزایش شعاع هیدرودینامیکی آلبومین به وسیله پگیلاسیون می تواند موجب کاهش عبور آلبومین از دیواره مویرگ ها و افزایش نیمه عمر آلبومین انفوزیون شده در بدن شود.هدف تولید آلبومین انسانی مونو پگیله با ویژگی های اصلاح شده از طریق کونژوگه نمودن آن با دو نوع پلیمر m-PEG-maleimide با ساختار متفاوت (شاخه دار و خطی ) در محل گروه تیولی آزاد موقعیت Cys34 و سپس مقایسه شعاع هیدرودینامیکی آلبومین پگیله شده و دست نخورده و نیز بررسی پروفایل بازداری آلبومین پگیله شده در جداسازی با روش کروماتوگرافی تعویض یونی.روش کار بعد از انجام واکنش پگیلاسیون، آلبومین کونژوگه شده به وسیله ژل فیلتراسیون و کروماتوگرافی تعویض یونی از سایر اجزا مخلوط حاصل از واکنش پگیلاسیون جدا شده و به وسیله الکتروفورز و کروماتوگرافی تعویض یونی آنالیز گردید.یافته ها آلبومین مونوپگیله با بازده 60 درصد تولید شد. با استفاده از منحنی کالیبراسیون و معادلات تخمین شعاع هیدرودینامیک،شعاع هیدرودینامیک آلبومین پگیله شده1/7 برابر آلبومین دست نخورده به دست آمد. نوع ساختار پلیمر (شاخه دار و خطی بودن) تاثیر چشمگیری در شعاع هیدرودینامیک پروتئین پگیله شده ندارد. تفاوت اندکی به نفع پروتئین پگیله با پلیمر دارای ساختار شاخه دار در زمان بازداری آلبومین پگیله شده با پلیمر خطی و شاخه دار در روش کروماتوگرافی تعویض یونی گزارش شد.نتیجه گیری پگیلاسیون آلبومین انسانی با mPEG-maleimide با وزن 20kDa باعث افزایش 7/1 برابری در شعاع هیدرودینامیک آن می شود. ساختار فضایی متفاوت پلیمر خطی و شاخه دار تفاوت اندکی در زمان بازداری در کروماتوگرافی تعویض یونی ایجاد کرد., Introduction Human serum albumin (HSA), the most abundant plasma protein, accounts for about 60% of the total protein in serum, that is used as an important plasma volume expander in clinical practice. However, the infused HSA may extravasate into the interstitial space and induce peripheral edema in treating the critical illness related to marked increase in capillary permeability. Such poor intravascular retention also demands a frequent administration of HSA. We hypothesize that increasing the hydrodynamic radius of HSA by PEGylation may be a potential approach to decrease capillary permeability of HSA.Aimssite-specific PEGylation of HSA that carries one chain of polyethylene glycol (PEG) (20 kDa) per HSA molecule was obtained. The effect of mPEG-Maleimide with different structure (branched and linear) on hydrodynamic radius of PEGylated HSA and on its retention profile in ion exchange chromatography was characterized. Method Pegylation was done and pegylated HSA was fractionated from reaction mixure by gel filtration and ion exchange chromatography (IEX). Puriy of separated fractions was analyzed using IEX and SDS-polyacrymalide gel electrophoresis.Result The yield of Pegylation was 60%. Retention volume of linear PEG-HSA and branched PEG-HSA, by applying linear gradient of NaCl in IEX was almost the same. Hydodynamic radius of pegylated albumin was 1/7times larger than that of native albumin.Discussion Calculating hydrodynamic radius shows that there was no significant difference between the hydrodynamic radius of branched and linear PEG-protein having the same total molecular weight of PEG adducts.Key words Human serum albumin, pegylation, IEX, m-PEG-maleimide, SEC