طراحي و ساخت PNA بيوسنسوربراي تشخيص توالي پلي مورفيك نوكلئوتيد 275-از ناحيه پروموتور ژن يوريدين دي فسفات گلوكرونوزيل ترانسفراز 1A9 (UGT1A9)

Abstract

تعداد زيادي از بيماري هاي ژنتيكي انساني ناشي از جهش هاي نقطه اي در ژن هاي خاص مي باشد. روش هاي مختلفي براي آناليز اينگونه جهش ها در محیط خارج از بدن موجود زنده (in vitro) ارائه شده اند كه از اين ميان استفاده از همانندهاي نوكلئوتيدي، تشکیل هيبريد با پروب هاي اوليگونوكلئوتيدي مخصوص الل ها و مطالعات اتصال با اوليگونوكلئوتيد ها حائز اهميت اند. آنزيم( UGT1A9 )علاوه بر حضور در لوله معدي-رودي و كليه اكثرا در ميكروزوم هاي كبد انساني قرار دارد و آنزيم كليدي در گلوکورونیداسیون برخي داروها از جمله مايكوفنوليك اسيد (MPA) است. بروز پلي مورفيسم تك نوكلئوتيدي (SNP) در نوكلئوتيد (A/T) 275- در محل پروموتور اين ژن باعث تغيير در فعاليت اين آنزيم به ميزان 17 برابر مي گردد كه نتيجه آن افزايش سرعت گلوکورونیداسیون برخي داروها نسبت به فرم نرمال ژن است . پپتيد نوكلئيك اسيد (PNA) ، رشته ی مشابه DNA مي باشد كه ستون فسفو دي استري آن توسط واحد هاي N-(2-آمينو اتيل ) گليسين جايگزين شده است و يك رابط متيل كربونيل باز ها را به آمينو نيتروژن هاي اين ستون وصل مي كند . اين مولكول هاي جديد و سنتتيك داراي ويژگي هاي شيميايي خاصي مي باشند و بر خلاف اسيد هاي نوكلئيك طبيعي ، مولكول هايي غير يوني، كايرال و مقاوم به تخريب هيدروليتيك توسط آنزيم ها بوده و اتصال كاملا اختصاصي و دقيقي با DNA برقرار مي كنند . همچنين اين مولكول ها از قوانين ايجاد باند هاي هيدروژني در مدل واتسون و كريك تبعيت مي نمايند. بدليل اتصال كاملا اختصاصي و قانونمند PNA با رشته DNA مكمل آن ، از آن به عنوان ابزاري در تعيين پلي مورفيسم تك نوكلئوتيدي (SNP) در بيوتكنولوژي و بيولوژي مولكولي استفاده مي شود . بدليل اهميت باليني عملكرد ژن UGT1A9 در متابوليسم دارو و احتمال بالاي بروز پلي مورفيسم در توالي پروموتور اين ژن خصوصا در سفيد پوستان و همچنين با توجه به توانايي اتصال اختصاصي رشته PNA با DNA ي مكمل آن ، در اين مطالعه بر آن شديم تا با تهيه بيوسنسورهاي مبتني بر PNA ، پلي مورفيسم تك نوكلئوتيدي محتمل در ناحيه 275- از توالي پروموتور ژن UGT1A9 را بواسطه روشهای الکتروشیمیایی بررسي نماييم. این سنسور بر پایه تثبیت پروب تک رشته ای 13 نوکلئوتیدی محدوده توالی پلی مورفیک فوق، بر روی الکترود طلا طراحی و تهیه شد. تشکیل هیبرید بین رشته پروب و رشته DNA مکمل آن (DcUG275) بعنوان توالی هدف، توسط روشهای ولتامتری پالس تفاضلی (DPV) و با بکارگیری شناساگر متیلن بلو (MB) بر روی سطح الکترود طلای اصلاح شده با پروب ارزیابی گردید. در این روش با بکار گیری رشته DNA دارای پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی، میزان تشکیل هیبرید بر پایه تفاوت سیگنالهای پالس تفاضلی حاصل از تجمع متیلن بلو بر روی الکترودها قبل و بعد از تشکیل هیبرید تعیین گردید. همچنین چندین آزمون تشکیل هیبرید نیز توسط رشته های غیر مکمل اولیگونوکلئوتیدهای DNA برای نشان دادن انتخابگری بیوسنسور مذکور به رشته هدف (مکمل) صورت گرفت. همچنین در این مطالعه برخی عوامل متغییر تاثیرگذار بر عملکرد بیوسنسور از جمله روش تثبیت پروب، زمان تثبیت پروب و غلظت پروب بررسی گردیدند. نتایج این مطالعات گویای عملکرد بهینه پروب در شرایط استفاده از محلول پروب در روش قطره گذاری در طی یک شبانه روز بود. نتایج حاصله حاکی از قدرت بالای انتخابگری بیوسنسور مبتنی بر PNA در افتراق رشته های مکمل، غیر مکمل و رشته دارای پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی بود.