بررسی امکان کلونینگ و تعیین توالی ژن کد کننده آنزیم تاناز از باسیلوس سرلوس

Abstract

در تحقیق حاضر تلاش شد برای اولین بار توالی ژن کد کننده آنزیم تاناز از باسیلوس سرئوس(Bacillus cereus) مشخص وثبت گردید. لذا جهت استخراج ، همسانه سازی و توالی یابی ژن کد کننده آنزیم تاناز از (B.cereus)سویه های PTCC :1015 ATCC: 11778 وPTCC:1247 CIP:7830 این باکتری از پژوهشکده بیوتکنولوژی تهران،بخش کلکسیون قارچهاوباکتریهی صنعتی وعنوانی ایران خریداری شد.چون تا کنون توالی هیچ ژن کد کننده آنزیم تاناز در باسیلوسها مشخص نشده بنابراین از طریق الاینمنت ژن کد کننده این آنزیم در سویه های قارچی آسپرژیلوس یک جفت پرایمر جلو برنده 20XF2 و پرایمر معکوس 40XR4 طراحی شد. سپس از طریق واکنشهای زنجیره ای پلیمراز(PCR)و در حضور ژنوم باکتریایی به عنوان DNA الگو و با کمک پرایمرهای مذکور قطعه مورد نظر تکثیر و از روی ژل الکتروفورز آگارز بریده و استخراج شد.قطعه استخراج شده به ناقل همسانه سازی pTZ57RT الحاق شدو سپس سلولهای E.coliسویه DH5a توسط این وکتورنوترکیب تراریخت شده و با کشت بر روی محیط LB انتخابی حاوی آمپی سیلین ،IPTGو XGAL غربال شده و کلنی های حاوی وکتور نو ترکیب از کلنی های نرمال جداسازی شدند. سپس2 کلنی تراریخت از هر کدام از سویه های باکتریای انتخاب شده و در محیط LB حاوی آمپی سیلین کشت داده شدند. پلاسمید این باکتریها استخراج شده و با دو آنزیم برشی Sacl وHindIII برش داده شد و وجود قطعه خارجی (Insert) در روی آن اثبات شد. سپس پلاسمیدهای استخراج شده با استات سدیم و اتانول خالص ترسیب داده شدند وجهت توالی یابی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شدند.نتیجه این توالی یابی در قطعه شماره 1015M2 از سویه ATCC:11788 خوانشی به طول 476 نوکلئوتید بود که در نتیجه Blast(n) در بانک اطلاعات نوکلئوتیدی 9799 درصد همخوانی با ژن کد کننده آنزیم DIhydrodipicolinate synthase در انواع سویه های باسیلوس نشان داد.Blast(P) این توالی حدود 158 اسید آمینه را کد می کند که 98 درصد همخوانی با ژن کد کننده این آنزیم در انواع سویه های باسیلوس نشان می دهد. نتیجه توالی یابی قطعه 1247M5 از باکتری CIP:7803 خوانشی به طول 532 نوکلئوتید بود که در نتیجه Blast(n) این توالی حدود 176 اسید آمینه را کد می کند که 9598 درصد همخوانی با ژن کد کننده این آنزیم در انواع سویه های باسیلوس نشان می دهد .نتیجه توالی یابی قطعه 1247M8 از سویه CIP:7803 خوانشی به طول 549 نوکلئوتید بود که نتیجه Blast(n) نشان داد که 41 نوکلئوتید ( ازابتدای قطعه اینسرت) با ژن کد کننده آنزیم Methionine gamma، 100درصد و 110نوکلئوتید(از انتهای قطعه اینسرت) با ژن کد کننده SSU ribosomal protein ، 99درصد درانواع سویه های باسیلوس همخوانی نشان می دهد و 398 نوکلئوتید باقیمانده مربوط بهقطعه بین ژنی است.با توجه به مطالب ذکر شده عدم تکثیر ژن تاناز از B.cereus در واکنش زنجیره ای پلیمر زنجیره ای پلیمراز از فرضیات و پیشنهادات ذیل را مطرح می سازد که به احتمال ضعیف ژن کد کننده این آنزیم در ژنوم B.cereus موجود نمی باشد و یا در صورت وجود ، به احتمال قوی ژن مزبور تفاوتهای ساختاری و نوکلئوتیدی اساسی با توالی ژن کد کننده همین آنزیم از میکروارگانیسمهای دیگر از جمله سویه های مختلف قارچ آسپرژیلوس دارد. در نتیجه پیشنهاد می گردد که پرایمرهای متعدد و متنوع برای تکثیر ژن کد کننده این آنزیم در بلسیلوسهای طراحی گردد،و ادامه این تحقیق با پرایمر های مختلف پیگیری گردد.