cytoplasmic endoproteases for cleavage of fusion proteins as therapeutic targets

Abstract

فورین یک پروتئاز سرینی وابسته به +ca2 از خانواده subtilisin kexin می باشد،که به طور اختصاصی پیش ناز های پروتئینی را از انتهای کربوکسیلی جایگاه Arg_Xaa_(LysArg) شکسته و پروتئینهای فعال مربوطه را ایجاد می نماید.نقش اساسی و مهم فورین در بسیاری از وقایع سلولی وابسته به عفونتهای ویروسی از قبیل HIV ،SARS ،آنتراکس و آنفولانزا و همچنین انواع سرطانها، مهار فعالیت این آنزیم را به یک موضوع مثلا تحقیقی در زمینه درمان تبدیل کرده است .تا کنون قویترین مهار کننده شناخته شده فورین ، پروتئینی به نام al_PDX از خانواده (serin protease inhibitors)serpin می باشد .بر اساس مطالعات انجام یافته، مشخص گردیده است که جایگاهی به نام Reactive Site Loop(RSL) در تمامی اعضای خانواده serpin جایگاه اولیه واکنش و مسئول عمل مهارکنندگی آنها می باشد .با این پیش فرض هدف اول از مطالعهحاضر، طراحی و توسعه مهارکننده پپتیدی با اندازه کوچک برعلیه فورین ، بر اساس ساختار RSL پروتئین al_PDX می باشد. مهارکننده مورد نظر که قابل سنتز در آزمایشگاه می باشد ،می تواند به عنوان یک ماده درمانی مورد توجه قرار گیرد.بدین منظور ، 15 پپتید مختلف بر اساس ساختار جایگاه RSL پروتئین al_PDX و با ایجاد موتاسیون های مختلف در این جایگاه و نواحی کناری ،از توالی اسید آمینه 367 تا 394 که حاوی جایگاه R_I_P_R بوده طراحی گردید، با استفاده از دستگاه اتوماتیک solid_phase peptide synthesizer سنتز و هویت آنها با روش اسپکترومتری جرمی MALDI_tof ، آنالیز اسیدهای آمینه و همچنین هضم با اندوپروتئاز Lys_C تایید گردید.بر اساس نتایج حاصل از مطالعات کینتیکی اولیه ، به منظور ارزیابی کلی اثرات مهار کنندگی پپتیدهای سنتزشده بر علیه فورین ،با استفاده از سوبسترای QVEGF_C (Abz_QVHSIIR SLP_Y(NO2)_A_CONH2,Abz=2_amino benzoic acid and Y(NO2)=3_nitro tyrosine) یکی از پپتیدهای سنتزشده که در جایگاه P3 به جای Ile380 اسید آمینه Leu جانشین شده است ،با توالی زیر انتخاب گردید. (Cys_367 KGTEAAGAMFLERLPRSIPPEVKFNKPF 394_Cys) در پپتید حاضر با بهره گیری از دو گروه سیستئین قرار داده شده دردو انتهای آن و با استفاده از روش اکسیداسیون با محلول ید و همچنین اکسیداسیون در هوا ،پل دی سولفیدی قرار داده شد و حلقوی گردید .دستیابی به حالت حلقوی ،با استفاده از مقایسه طیف MALDI_tofپپتید حلقوی و غیر حلقوی که اختلاف 2 دالتون را در وزن مولکولی ناشی از حذف 2 مولکول هیدروژن در پپتید حلقوی نشان می داد ،ثابت گردید . همچنین مقایسه نتایج حاصل از اسپکترومتری جرمی MALDI_tof در مورد پپتید حلقوی و غیر حلقوی آلکیله شده با یدو استامید در حضور و عدم حضور ماده احیاکننده Tri(2_carboxyethy1)phosphine(TCEP)،نشان داد که در مورد پپتید حلقوی پس از احیا با TCEPوزن یدو استامید به پپتید افزوده گردیده در حالی که در آلکیلاسیون بدون حضور ماده احیاکننده ،تفاوتی در وزن پپتید ملاحظه نگردید که ساختار حلقوی پپتید مورد نظر را تایید می نماید .در مودر پپتید غیر حلقوی در هر دو حالت افزایش در وزن مولکولی پپتید مشاهده گردید .نتاج حاصل از مطالعات کینتیکی invirto با استفاده از سوبسترای QVEGF_C نشان داد که هم پپتید حلقوی و هم غیرحلقوی در مقیاس IC50 نانو مولار ،فعالیت فورین را مهار نموده و مکانیسم مهار آنریم از الگوی اتصال کند slow binding تبعیت می نماید .این مطالعه ثابت نمود که ساختارRSL پروتئین al_PDX برای مهار آنزیم فورین اساسی است ،)و این تحقیق روش نوینی برای توسعه مهارکننده های جدید با قابلیت استفاده به منظور اهداف درمانی ارائه می نماید.هدف دوم از مطالعه حاضر ،ساخت حامل بیان کننده ایی است که دو پروتئین به هم جوشیده حاوی جایگاه هضم آنزیمی فورینArg_Xaa_(Lys Arg)_Arg را بین دو پرتئین به هم متصل را کد نماید .چنین ترکیب پروتئینی اگر نشان داده شود که در سیتوپلاسم سلولها بوسیله فورین شکسته می شود ،می تواند یک سیستم بیولوژیک جدید برای انتقال دو یا چند پروتئین به وسیله یک وکتور واحد به داخل سیتوپلاسم سلولها باشد. بدین منظور GAL4 وVP16 به عنوان پروتئین مدل استفاده گردیدند.دو جایگاه هضم فورین قبلا توسط دکتر حجازی و همکاران بین این دو پروتئین قرار داده شده بود.این دو قطعه VP16 GAL4)DNA با جایگاه هضم آنزیمی فورین مابین آنها) با استفاده از نکنیک PCR تکثیر گردیدو به داخل پلاسمیدA pUB6V5_His کلون گردید.این پلاسمید یک حامل کلون کننده بیان کننده می باشد که حاوی DNAکدکننده His_tag در انتهای 3 جایگاه چندگانه کلونینگMultiple cloning site(MCS) ،می باشد که باعث اتصال 6 گروه هیستیدین به انتهای کربوکسیلی پروتئین بیان شده می گردد.کلونینگ قطعه مورد نظر به داخل حامل پلاسمیدی توسط هضم به وسیله آنریمهای مناسب ،آزمایش PCR با کلون های به دست آمده و همچنین تعیین توالی وکتور نو ترکیب تایید گردید. به منظور ارزیابی شکسته شدن پروتئین مرکب GAL4VP16 حاوی جایگاه هضم آنزیمی فورین در سیتوپلاسم سلولها ،وکتور نوترکیب حاصل به سلولهای Hela با تکنیک ترانسفکشن انتقال یافت و نحوه بیان پروتئین با استفاده از تکنیک SDS PAGE و وسترن بلاتینگ بررسی گردید که تنها وجود یک باند در حوالی KDa 25 حاکی از عدم شکسته سدن پروتئین GAL4VP16 بود.نتیجه تحقیق حاضر به طور قطع حضور فورین در سلولهای مورد آزمایش را رد می کندو نشان می دهد که پروتئینهای به هم جوشیده حاوی جایگاه هضم فورین شانس کمی برای بیان هم زمان در سیتوپلاسم دارند.متد حاضر روش نوینی برای بررسی لوکالیزاسیون آنزیمها در داخل سلولها بوده و می تواند برای ارزیابی لوکالیزاسیون سایر آنزیمها نیز به کار رود.