ساخت وکتورPB7G4VP و بررسی بیان پروتئین بهم چسبیده نوترکیب B7.1GAL4_VP16 در غشاء سیتوپلاسمی سلولهای حیوانی

Abstract

پروتئین B7_1 یک پروتئین غشایی تیپ Iمیباشد.این پروتین درفعال سازی لنفوسیتهای Tدر جهت ایجاد پاسخ ایمنی عمل مینماید. B7_1 بالغ دارای 254 آمینواسید است و وزن مولکولی آن KDa 7045 میباشد. پروتئینهای GAL4_VP16 بعنوان پروتئینهای فعال کننده رونویسی اسیدی مطرح هستند.GAL4 با شناسایی جایگاه مشخصی از توالی DNA مخمر و قرارگیری بر روی آن باعث فعال شدن رونویسی در این سلولها می گردد.VP16 به تنهایی دارای توالی شناسایی کننده جایگاه مشخصی از DNA نیست.این پروتئین که برای اولین باردرویروس هرپس شناسایی گردید می تواند بااتصال بهسایرپروتئینهای فعال کننده رونویسی باعث تسهیل عملکرد آنها گردد.سیستم بیولوژیک مورد نظراز3 پروتئین به هم پیوسته تشکیل یافته که مجموعا یک پروتئین نوترکیب مرکب سه تایی را تشکیل میدهند که برای شناسایی اندوپروتئازهای غشایی بکار گرفته شد. دراین سیستم DNA کدکننده سه پروتئین VP16,GAL4,B7_1 به هم متصل و در پلاسمید pcmB7_1 به صورت inframe کلون گردید. پروتئین B7_1 یک پروتئین غشایی با سه قسمت داخل سیتوپلاسمی، داخل غشایی و خارج سلولی است. این پروتئین باعث حرکت و جهت گیری مجموعه فوق به سمت سیتوپلاسم ولوکالیزاسیون پروتئین نوترکیب مرکب در غشا سلولی میشود. پروتئینهای GAL4_VP16 نیز در صورت جداشدن توسط اندوپروتئازهامی توانند باعث فعالشدن ژنهای مارکر خاصی گردند.در این تحقیق قصد برآناست که ژن کدکننده B7_1GAL4_VP16 را دریک وکتور مناسب که توانایی بیان در سلولهای یوکاریوتیک داشته باشد، وارد کرده و سپس بیان یاعدم بیان آنرا در این رده سلولی بررسی نمائیم.لذا پلاسمیدهای pcG4VP(T) به عنوان الگو جهت PCR ونیز pcmB7_1 بعنوان حامل، درداخل سلولهای DH5_a ترانسفورم شده و سپس استخراج به روش لیز قلیایی صورت گرفت. پس از تکثیر با توجه به توالیهای مربوط به آنزیمهای Acc651 وHindIII از طریق واکنش PCR، ژن کدکننده GAL4_VP16 درپلاسمید pcmB7_1 وارد شده و پلاسمید نوترکیب در باکتری E_coli گونه DH5_a کلون وتکثیر گردید. پس ازتائید نتایج حاصل از کلون کردن، بمنظور بدست آوردن غلظت های بالا از پلاسمید نوترکیب ساخته شده، کشت شبانه از باکتری های دارای پلاسمید نوترکیب بعمل آمده واستخراج به روش لیزقلیایی در مقیاس انبوه صورت گرفته و پلاسمید استخراج شده پساز تائید وجود اینسرت در آن، برای انتقال به سلولهای Hela انتخاب گردید. تعداد سلولهای مورد نیاز در هر پلیت5 (10)* 2بوده که این مقدار سلول پس از خارج کردن سلولها از فریزر وشمارش و کشت سلولها به دست آمد.روش رسوب باکلسیم فسفات برای انتقال پلاسمید نوترکیب به سلولهای Hela بکار گرفته شده و سلولهای Hela پس از ترانسفکشن در انکوباکتر 37 درجه با فشار atm 5قرار داده شدند. پس از 48 ساعت سلولها را تریپسینه کرده و برای بررسی بیان پروتئنهای GAL4_VP16 بکمک تست Western_Blotting، آنها را آماده نمودیم. نتایج حاصلاز برش پلاسمید نوترکیب ساخته شده باژانزیم های Acc651 و HindIII دلالت به صحت کلون سازی و وجود اینسرت در پلاسمید نوترکیب را دارد. با توجه بهاین که سلولهای Helaی دریافت کننده این پلاسمید در محیط حاوی Hygromycin رشد کردند، ترانسفکشن نیز تائید میگردد.