کلونینگ و بیان IL_2 انسانی در سلولهای یکاریوتیک

Abstract

اینترلوکین 2(فاکتور رشد سلول های (Tگلیکوپروتئین تظاهریافته طبیعی با 133آمینواسید بوده که بطور طبیعی در درمان کارسینوم متاستاتیک سلولهای کلیوی و بطور غیر رسمی در درمان کاپوزیس سارکوما مصرف می شود.این پروتئین باعث افزایش میتوژنز لنفوسیتهاو تحریک طولانی مدت رشد رده سلولهای وابسته بهاینترلوکین 2و نیز القاء فعالیت سلولهای کشنده طبیعی میگردد.دراین تحقیق قصد بر آن است که ژن کدکننده IL_2 رادریک وکتورمناسب کهتوانایی بیان درسلولهای یوکاریوتیک داشته باشد، وارد کرده وسپس بیان یاعدم بیان آنرادراین رده سلولی بررسی نمائیم.لذا پلاسمیدهای r_pwhIL_2,b7.1M بعنوان الگو جهت PCR ونیز pcDNA3.1()neo بعنوان حامل،درداخل سلولهای DH5_a ترانسفورم شده و سپس استخراج به روش لیز قلیایی صورت گرفت.پساز تکثیر با توجه به توالیهای مربوط به آنزیمهای BamHI وHindIII از طریق واکنش PCR، ژن کد کننده IL_2 در پلاسمید pcDNA3.1()neo وارد شده و پلاسمید نوترکیب در باکتری E_coli گونه DH5_a کلون و تکثیر گردید. پس از تایید نتایج حاصل از کلون کردن، بمنظور بدست آوردن غلظتهای بالا از پلاسمید نوترکیب ساخته شده، کشت شبانه از باکتری های دارای پلاسمید نوترکیب به عمل آمده و استخراج به روش لیز قلیایی در مقیاس انبوه صورت گرفتهو پلاسمید استخراج شده پس از تائید وجوداینسرت درآن،برای انتقال به سلولهای HeLa انتخاب گردید. تعداد سلولهای مورد نیاز در هر پلیت5 (10)* 2بوده که این مقدار سلول پس از خارج کردن سلولها از فریزر و شمارش و کشت بدستآمد. روش رسوب با کلسیمفسفات برای انتقال پلاسمید نوترکیب به سلولهای HeLa بکار گرفته شده و سلولهای HeLa پس از ترانسفکشن در انکوباتور 37 درجه با فشار atm 5قرار داده شدند.پس از 48 ساعت بمنظور بدست آوردن سلولهای پایدار (stable)، سلول های کشت داده شده تحت تیمار باآنتی بیوتیک G_418 با غلظت Mgml 100قرار گرفتند. پس از گذشت یک ماه از تیمار با آنتی بیوتیک برای اندازهگیری میزان تولید IL_2 از محیط کشت سلولهای نوترکیب SDS Page بعمل آمد. نتایج حاصل از برش پلاسمید نوترکیب ساخته شده با آنزیمهای BamHI وHindIII دلالت بر صحت کلون سازی و وجود اینسرت در پلاسمید نوترکیب را دارد.ضمن اینکه باکتریهای دریافت کننده‌ء پلاسمید در محیط حاوی آمپیسیلین رشد کردهاند که این خود دلیل دیگری بر تائید ترانسفورمیشن و وجود اینسرت در پلاسمید نوترکیب را دارد. با توجه به این که سلولهای HeLaی دریافت کننده این پلاسمید در محیط حاوی G_418 رشد کردند ترانسفکشن نیز تایید میگردد. با توجه به نقش LI_2 در تحریک رشد لنفوسیت های T و نیز کاربرد درمانی آن، تولید این پروتئین از طریق تکنولوژی DNA نوترکیب گامی مفید درجهت بدستآوردن این دارو در مقیاس انبوه میباشد. با توجه با نقایص موجود در سیتم های نوترکیب موجود که براساس بیان ژن در سلولهای باکتریایی عمل میکنند، سلولهای یوکاریوتیک انتخاب گردیدند. این رده سلولی مشکل کاهش فعالیت پروتئین نوترکیب را در مقایسه با پروتئین طبیعی و نیز عدم گلیکوزیلاسیون پروتئین نوترکیب را که در تولید پروتئین با سلولهای باکتریایی وجود دارد را حل مینماید. بعداز تهیه سلولهای ترانسفکت شده پایدار وجود IL_2 در محیط کشت بروش SDS PAGE بررسی شد.نتایج بدست آمده از تست فوق دلالت بر بیان پروتئین نوترکیب در سلولهای یوکاریوتیک داشت.