مطالعه اثرات ضد التهاب وضد تجمع لوکوسیتی گیاه Stachys schtschegleevii

Abstract

گیاه Stachys schtschegleevii از جنس Stachys وخانوادهنعناییان است کهبصورت وسیع درمناطق شمالغرب ایران پراکنده می باشد. عصاره بدست آمده از قسمتهای هوایی Stachys schtschegleevii در طب سنتی ایرانیان دربیماریهای عفونی، روماتوئیدی وسایر بیماریهای التهابی مورد استفاده قرار می گیرد. در این مطالعه خواص ضد التهابی عصاره های مختلف به دست آمده از قسمتهای هوایی گیاهStachys schtschegleevii مورد مطالعه قرار گرفته است. روش کار عصاره های تام هیدروالکلی، پترولی، کلروفورمی، اتیل استاتی، انبوتانولی ومایی از سرشاخههای گیاهStachys schtschegleevii به روش ماسراسیون وبا استفادهازاواپراتور تحت فشار کم تهیه گردید. مدل التهاب حاده ادم ناشی از تزریق کاراژنین در کف پای موش برای بررسی اثرضدالتهاب مورد استفاده قرار گرفت. به منظور مطالعه اثرات ضد درد گیاه از مدل درد حاد ناشی از تزریق فرمالین به کف پای موش صحرایی استفاده شد. با استفاده از اندازهگیری فعالیت آنزیم میلوپراکسیداز به روش اسپکتروفتومتری میزان تجمع نوتروفیلی در بافت ملتهب به صورت کمی اندازهگیری گردید. مطالعات هیستولوژیکی به منظور بررسی کیفی تجمع نوتروفیلی و آسیبهای بافتی ناشی از التهاب انجام پذیرفت. مدل آسیب ناشی از رپرفیوژن پس از ایسکمی در بافت قلبی به منظور مطالعه اثر گیاه بر نکروز بافتی پس از رپرفیوژن مورد استفاده قرار گرفت. برای شناسایی ترکیبات مسئول اثر ضد التهاب و ضد تجمع نوتروفیلی عصاره اتیلاستاتی با استفاده از روش کروماتوگرافی ستونی به 11 فراکسیون عمده مجزا شد. و اثرات ضد التهاب هر فراکسیون مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج و بحث تزریق داخل صفاق عصاره تام هیدروالکلی سرشاخههای بدون گل گیاهStachys schtschegleevii به موشهای صحرایی باعث مهار قوی و وابسته به دوز در پاسخ التهابی ناشی از کاراژنین شد. تزریق عصاره با دور 200 میلیگرم بر کیلوگرم ( 60دقیقه قبل از ایجاد التهاب) به طور معنیدار باعث کاهش پاسخ التهابی ماکزیموم به دست آمده در ساعت چهارم(از 47 +یا 9000 درصد به 64 +یا 5500 ،(P0.01و کاهش ادم توتال اندازهگیری شده بر حسب سطح زیر منحنی (AUC) به میزان566 ,شد، (از(,IPT).hr 157 +یا 24100 در گروه کنترل به(,IPT).hr 193 + یا 11960 در گروه دریافت کننده عصاره،.(p0.001 دوز درمانی استاندارد ایندومتاسین ( 25میلیگرم بر کیلوگرم به صورت داخل صفاق) اثر مهار کمتری (313,مهار) نسبت به عصاره با دوز 200 میلیگرم بر کیلوگرم نشان داد. تزریق داخل صفاق عصاره تام هیدروالکلی سرشاخههای گلدار گیاه Stachys schtschegleevii به موشهای صحرایی هیچ اثر ضد التهابی را ایجاد ننمود. چهار ساعت پس از تزریق کاراژنین در اوج التهاب افزایش چشمگیری در انفیلتراسیون نوتروفیلی به بافت ملتهب دیده شد. فعالیت آنزیم میلوپراکسیداز در بافت پا از 30 + یا میلی واحد بر 100 میلیگرم از بافت در گروه کنترل به از 19 + یا 600 میلیواحد بر 100 میلیگرم از بافت در گروه تحت القای التهاب حاد توسط کارانین افزایش یافت. عصاره تام هیدروالکلی با دوز 200 میلیگرم بر کیلوگرم (60دقیقه قبل از تزریق فرمالین) اثر معنیداری در فاز اول تست فرمالین ایجاد نکرد، اما منجر به بلوک معنیدار فاز دوم و کاهش زمان لیسیدن پا 190 +یا 23500 ثانیه به 137 + یا 14040 ثانیه، .(p005) بلوک انتخابی فاز دوم تست فرمالین توسط عصاره تام هیدروالکلی گیاه Stachys schtschegleevii نشان میدهد که عصاره حاوی موادی است که مدیاتورهای التهابی عامل ایجاد درد در فازدوم را مهار مینماید. پاسخ التهابی میتواند منجر به آسیب بافتی پس از رپرفیوژن ایسکمیک شود. انفزیون دوز پایین از عصاره تام هیدروالکلی (30mg.kg .min) منجر به کاهش معنی دار(p001) در انفارکت سایز از میزان 25 +یا 4820 درصد در گروه کنترل به 62 +یا 297 درصد در گروه دریافت کننده عصاره شد. در صورتی که میزان انفارکت سایز با دوز بالاتر عصاره(70mg.kg .min) 34 +یا 5560 درصد بود که تفاوت معنی داری با گروه کنترل نداشت. این نتایج نشان میدهد که احتمالا عصاره تام هیدروالکلی گیاه Stachys schtschegleevii حاوی مواد التهابزا وضد التهاب به صورت توام است. عصاره هیچگونه تاثیری بر آریتمی ناشی از ایسکمی،ضربان قلب وفشار خون نداشت. عصاره پترولی گیاهStachys schtschegleevii بادو دوز 100و 200میلی گرم بر کیلوگرم اثر مهاری بر التهاب ایجاد شده توسط کاراژنین نداشت. در حالی که دوز 100 میلی گرم بر کیلوگرم از عصاره کلروفورمی اثرات ضد التهاب قابل توجه از خود نشان داد. این دوز باعث مهار پاسخ التهابی د ساعات سوم و چهارم پس از تزریق کاراژنین شد.(p001) در صورتی که با افزایش دوز عصاره کلروفورمی به 400 میلی گرم بر کیلوگرم پاسخ التهابی افزایش یافت و پاسخ التهابی ماکزیمم بدست آمده در ساعت چهارم از 50+یا 8732 درصددر گروه کنترل به 49 +یا 10982 درصد در گروه دریافت کننده عصاره رسید.(p001) پاسخ التهابی توتال از میزان (,IPT).hr 81 +یا 19695در گروه کنترل به (,IPT).hr 149 +یا 23995 در گروه دریافت کننده عصاره ( 400میلی کرم برکیلوگرم) افزایش یافت،.(p005) تناقض بین اثرات مهاری دوزهای پایین و اثرات التهاب زایی دوز بالا از عصاره کلروفورمی میتواند اثرات مشاهده شده با دوزهای متفاوت عصاره هیدروالکلی را توجیه نماید. دوزهای پایینتر عصاره تام هیدروالکلی اثرات ضدالتهابی معنیدار داشت در حالیکه دوز بالاتر بی اثر بود. بنابراین میتوان چنین استنتاج نمود که گیاهStachys schtschegleevii بصورت توام حاوی اجزای ضدالتهابی والتهاب زا است. حداقل دو فلاوونوئید در عصاره کلروفورمی گیاهStachys schtschegleevii شناسایی گردید. این دو فلاوونوئید xanthomicrol وcisimaritin نام دارند. ترکیب xanthomicrol یک مهارکننده ضعیف COX است در صورتی که اثر مهارکنندگی آن بر لیپواکسیژناز قویتر است. ترکیب cirsimarritin باعث50 ,مهارCOXI وCOXII میشود و اثرات آنتی اکسیدانی ضعیفی دارد. اثر ضدالتهابی عصاره کلروفورمی با دوز پایین را میتوان به واسطه اثر مهاری xanthomicrol بر آنزیم لیپواکسیژناز وCOX و یا اثر مهاری cirsimaritin برCOXI وCOXII واثر آنتی اکسیدانی آن توجیه نمود. اثر التهاب زا معنی دار مشاهده شده با دوز بالایی عصاره کلروفورمی را میتوان به این ترتیب توجیه نمود که اثر قویترxanthomicrol بر لیپواکسیژناز نسبت بهCOX منجر به بلوک مسیر متابولیسمی لیپواکسیژناز شده و در نتیجه میزان اسید آراشیدونیک بیشتری در اختیار مسیر متابولیسمی COX برای سنتز پروستاگلندینهای التهابی قرار می گیرد. همچنین ممکن است cirsimaritin در دوز بالا ازطریق افزایش اکسیداسیون وابسته به NADPH تحریک شده توسط اسید آراشیدونیک اثرات پرواکسیدانی اعمال نماید.عصاره اتیل استاتی گیاهStachys schtschegleevii منجر به مهار قوی و وابسته به دوز التهاب ناشی از کاراژنین شد. عصاره اتیل استاتی بصورت معنی دار ماکزیمم پاسخ التهابی بدست آمده در ساعت چهارم را از 112 +یا 780 درصد در گروه دریافت کننده عصاره با دوز400 میلی گرم برکیلوگرم کاهش داده است، . (p001)افزایش دوز منجر به کاهش سطح زیر منحنی (AUC)از(,IPT).hr 157 +یا 25115 در گروه کنترل به(,IPT).hr 177 +یا 23327 در گروه دریافت کننده عصاره با دوز100 میلی گرم بر کیلو گرم به(,IPT).hr 192 +یا 20539 در گروه دریافت کننده عصاره با دوز 200 میلی گرم برکیلو گرم وبه(,IPT).hr 142 +یا 17670 در گروه دریافت کننده عصاره با دوز 400 میلی گرم بر کیلوگرم شد. تزریق داخل صفاق عصاره های ان بوتانولی ومایی اثرات ضد التهاب ضعیفتری نسبت به عصاره اتیل استاتی نشان داد. به منظور یافتن ترکیبات فعال مسئول اثر ضد التهابی عصاره اتیل استاتی، 11 فراکسیون بدست آمده از این عصاره به روش کراماتوگرافی ستونی در مدل التهابی ادم ناشی کاراژنین مورد مطالعه قرار گرفت. بهترین اثر ضد التهابی با فراکسیونهای8 ، 9 و 10 با دوز 30 میلی گرم بر کیلو گرم دیده شدند،(P0.001) با استفاده از روش کروماتوگرافی روی غشای نازک (TLC) مشخص گردید که این فراکسیون ها حاوی مشتقات اسید کافئیک می باشند. احتمال می رود که مشتقات اسید کافئیک مانند stachysoside در رده ترکیبات ضد التهابی موجود در این فراکسیونها باشند. فراکسیونهای5 و 6ایجاد اثرات ضد التهاب معنی دار نمودند ولی این اثرات نسبت به اثر ضد التهابی فراکسیونهای8 ،9و 10ضعیفتر بود. با استفاده از روش TLC مشخص گردید که گلیکوزیل فلاوونوئیدها ترکیبات عمده موجود در ابن فراکسیونها هستند و اثر ضدالتهابی متوسط این فراکسیونها به احتمال زیاد مربوط به فلاوونوئیدهای موجود در این فراکسیون ها است. فراکسیون 7 که حاوی گلیکوزیل فلاوونوئیدهای قطبی میباشد فاقد هرگونه اثر ضدالتهابی بود. کریستالیزاسیون فلاوونوئیدهایی که دارای زنجیره طولانی تری از قندها هستند (فلاوونوئیدهای قطبی تر) می توانند منجر به کاهش حلالیت و در نتیجه کاهش اثرات ضدالتهابی گردد. نتیجهگیری نتایج نشان داد که عصاره تام هیدروالکلی سرشاخههای فاقد گل گیاهstchys schtschegleevii باعث کاهش چشمگیر در پاسخ التهاب حاد میشود و به احتمال زیاد بیشترین نقش در رابطه این اثر مربوط به مشتقات اسید کافئیک و پس از آن گلیکوزیل فلاوونوئیدها میباشد. عصاره همچنین حاوی مواد التهاب زا میباشد که در فاز چرب عصاره وجود دارند. فاز چرب عصاره علاوه بر ترکیبات التهاب زا حاوی دو فلاوونوئید است xanthomicrol وcirsimaritinاست که در دوزهای پائین عصاره فاز چرب اثرات ضدالتهابی خوبی اعمال میکنند.