خالص سازی آلبومین انسانی از خون کامل با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی

Abstract

آلبومین به عنوان مهمترین پروتئین پلاسما، بیش از 50 درصد از پروتئین های سرم را در افراد سالم تشکیل می دهد. آلبومین نقش کلیدی در حفظ فشار انکوئیدی پلاسما دارد و همچنین به عنوان یک پروتئین حامل عمومی برای انتقال بسیاری از لیگاندهای درون و برون سلولی شناخته می شود. ازجمله کاربرد های آلبومین در زمینه های تحقیقاتی می توان به استفاده از آن در آزمایشگاه بعنوان پایدارکننده برای انواع نمونه ها، بعنوان یک مکمل محیط کشت سلولی، وسیله ای برای حمل دارو اشاره کرد. در این مطالعه به منظور تسهیل خالص سازی آلبومین و افزایش خلوص آن، کروماتوگرافی ایمونوافینیتی به کار گرفته شد و با روش معمول کوهن تلفیق شده با کروماتوگرافی مقایسه شد.روش ها: پس از ایمونیزاسیون خرگوش ها، تست های Passive Immunodiffusion و الایزا غیرمستقیم برای ارزیابی تولید آنتی بادی پلی کلونال علیه آلبومین انسانی صورت پذیرفت. آنتی بادی پلی کلونال تولیدی با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی و تمایلی (با پروتئین G) تخلیص گردید. از الكتروفورز SDS-PAGE برای ارزیابی خلوص آنتی بادی استفاده شد. سپس آنتی بادی به ژل سفارز متصل گردید و از آن برای خالص سازی آلبومین از سرم انسان استفاده شد. وسترن بلات به منظور ارزیابی تولید آلبومین انجام گرفت. خلوص آلبومین حاصل از کروماتوگرافی ایمونوافینیتی با روش مرسوم کوهن تلفیق شده با کروماتوگرافی مقایسه گردید.یافته ها: تیتر آنتی بادی تولیدی علیه آلبومین انسانی 25600/1 تعیین گردید. الکتروفورز SDS-PAGE خلوص آلبومین تولیدی را تقریبا 98% نشان داد که هم تراز با روش کوهن همراه شده با کروماتوگرافی می باشد. آنالیز وسترن بلات، صحت تولید آلبومین انسانی را تایید نمود. , As the most predominant plasma protein, albumin constitutes more than 50% of the serum proteins in healthy individuals. It has a key role in oncotic pressure maintenance and it is known as a versatile protein carrier for transportation of various endogenous and exogenous ligands. Further applications in research consist of as a supplement in cell culture, drug delivery carrier, and stabilizer of some of the proteins. In this research, to facilitate albumin purification and improving its purity, immunoaffinity chromatography was applied and compared with Cohn joined chromatography method.Methods: After immunization of rabbits, passive immunediffusion and indirect ELISA tests were applied for assessment of polyclonal antibody production against HSA. Purification was performed by ion exchange chromatography (IEC) and protein G affinity chromatography. SDS-PAGE analysis was done to evaluate the purity of anti-HSA IgG. The anti-HSA IgG was attached to the sepharose and applied for albumin purification from human serum. Western blotting (WB) analysis was done for assessment of HSA production. Purity of produced albumin using immunoaffinity chromatography was compaired with the purity resulted from a coomon method- a combination of Cohn and chromatography.Results: The optimum titer of anti-HSA was 1/256000. The SDS-PAGE showed that the purity rate of albumin was approximately %98, which is similar to Cohn and chromatography combination method. WB analysis confirmed the production of HSA.