میزان بیان مارکر TDT (ترمینال دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز)و تاثیر مهارآن بر سلول‌های B و T تمایزیافته از سلولهای CD34+ خون بند ناف

Abstract

ترمینال دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز (TdT) مسئول اضافه کردن نوکلئوتیدها در فرآیندترکیب ژنی(Gene Recombination) است. این آنزیم در سلول‌های PreB و PreTوجود دارد که در لوکمی ها افزایش پیدا می کند.هدف از مطالعه حاضر بررسی میزان بیان TdTدرسلول های تک هسته ای خون بندنافبا استفاده ازسایتوکین هایی ماننداینترلوکین-2، اینترلوکین-7، اینترلوکین- 15،SCF و FLT3است. همچنین بررسی تاثیر مهاراین آنزیم با استفاده از جنستین بر روی تکامل سلول های B وT در سلول های تک هسته ای و بنیادی خون‌ساز بند ناف جنین (CD34+) می¬باشد.مواد و روش¬ها:سلول¬های تک‌هسته‌ای با استفاده از فایکول ازخون بند ناف جداسازی شدند. سپس سلول‌ها به مدت بیست و یک روز در ترکیب¬های مختلفی از سایتوکاین¬ها کشت داده شدند.سطح بیان آنزیم TdT در روز¬هایهفت، چهارده و بیست‌ویکبا استفاده از روشفلوسایتومتری اندازه‌گیری گردید. سپس سلول‌هایCD34+ به مدت بیست و یک روزدر حضوراینترلوکین-2، اینترلوکین-7، اینترلوکین- 15،SCF و FLT3 کشت داده شدند و سپس برای مهار TdT سلول های تک هسته ای و سلول های بنیادی در روز بیست و یک به مدت 48 ساعتبا جنستین انکوبه شدند و سپس نمونه ‌هابرای اهداف مختلف با استفاده از فلوسایتومتری بررسی گردیدند.نتایج: میزانآنزیمTdTبا استفاده از سایتوکین ها افزایش می یابد اما به نوع سایتوکین ارتباطی ندارد. همچنین مهار TdT با جنستین باعث کاهش B cell ها و کاهش میزان T cellمی شود و همچنین باعث کاهش فرآیندتکثیروآپوپتوز می شود., Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)is responsible for inserting nucleotides to the junctions of gene segment during gene recombination. TdT gene is present in pre-B and pre-T cells and increases in some human leukemia’s.The aim of this study is to evaluate TdT expression in cord blood mononuclear with using different key immune cell cytokines like IL-2, IL7, IL15, SCF and FLt3. In addition, the influence of TdT inhibition by genistin on the generation of T- and B-cells in MNC and CD34+ cells is also evaluated.Material and Methods: The mononuclear cells were isolated from umbilical cord blood by Ficoll-Paque density gradient..Then MNC cells were cultured for 21 days in the presence of different cytokines. TdT gene expressions were evaluated in freshly isolated MNC cells 7, 14 and 21 days of culture by Flow cytometry. Then CD34+ cells cultured for 21 days in the presence of Interleukin-2 (IL-2), interleukin-7 (IL-7) , and interleukin-15 (IL-15),SCF and FLt3. For inhibition of TdT expression, MNC and CD34+ cells harvested on the 21st day of the culture were incubated with 50M of genistin for 48 hours in incubator. Afterwards, the samples were evaluated for different aims by flow cytometry. Results:that TdT expression increased using cytokines, however, it was not dependent on the type of cytokines. Inhibition of TdT by genistin reduced B and T cell expansion. As well apoptosis and proliferation have been reduced.