تأثیر میکرووزیکول‌های حاصل از سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSC-EV) بر تمایز سلول‌های بنیادی خون‌ساز مشتق از خون‌بندناف CD34+ به سمت ردهی مگاکاریوسیتی

Abstract

مغز‌استخوان(BM )حاوی دو نوع سلول بنیادی است.سلول‌های بنیادی خون‌ساز (HSC)که توانایی خود نوزایی و تمایز به رده‌های مختلف سلول‌های خونی رادارند.سلول‌های بنیادی مزانشیمی(MSC) از طریق بیان مولکول‌های چسبندگی متعدد، واکنش‌های سلول- سلول و سلول- ماتریکس، فاکتورهای رشد و میکرووزیکول¬‌ها(MVs)نقش حمایتی از خون‌سازی رادارند. MVها ازغشاءپلاسماییانواعمختلفسلول¬هاآزادمیشوند کهازنظرترکیبومارکرهایسطحیمتفاوت هستند.اینMV هاحاویبخشی از ترکیبات سیتوپلاسمی همانندسایتوکاین¬ها،پروتئین¬هایسیگنالینگ،miRNA، siRNAوmRNAهستند. هدف از این مطالعه بررسی تأثیر میکرووزیکول‌های حاصل از MSC‌های مشتق از خون‌بند ناف (MSC-MVs) بر تمایز HSCهای CD34+ مشتق از خون‌بند ناف به سمت ردهی مگاکاریوسیتی میباشد.مواد و روش کار: در این مطالعه¬ی توصیفی، MSC ‌ها از نمونه بند ناف در محیط کشت DMEMحاوی 10%FBSکشت داده شدند. مایع رویی کشت جهت جداسازی MVها اولتراسانتریفوژ شد. HSC های CD34+از منبع خون‌بند ناف انسانی توسط روش MACSجداسازی ‌شدند. میزان خلوص سلول¬های +CD34 از طریق فلوسایتومتری تعیین شد ودرصدزنده‌بودنسلول‌هابا روش تریپان بلو بررسی شد. HSC ها در محیط IMDMحاوی سایتوکاین¬ها وMSC-MVها در سه شرایطکشت داده شدند. سپسمیزان تمایز مگاکاریوسیتی به¬وسیله¬ی بیان مارکرها و ژن¬های اختصاصی بعد از 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. درنهایتداده¬های به‌دست‌آمده توسط تست آماریnon parametric t-Student مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفت(P<0.05).یافته‌ها:بیان مارکرهای اختصاصی ردهی مگاکاریوسیتی(CD41/61)در حضور غلظت¬های مختلفMSC-MVها نسبت به گروه کنترل. هیچ¬گونه اختلا معناداری را نشان نمی¬داد.همچنین،بیان ژن‌های اختصاصی ردهی مگاکاریوسیتی (GATA1, GATA2, FLI1 و c-Mpl) نسبت بهکنترل داخلی ژن GAPDHنرمال سازی شدند.بیان ژن¬هایGATA2و c-Mplافزایش معناداریرانشانداند؛ بیان ژن GATA1کاهش را نشان داد اما معنادار نبود و بیان ژن FLI1 کاهش معناداری را نشان داد؛نتایج،نشان‌دهندهیعدم تقویت تمایزHSC ها به سمت ردهی مگاکاریوسیتی در پاسخ به اثر سینرژیسم سایتوکاین¬ها وMSC-MVها بود., Bone marrow (BM) contains two distinct stem cell populations. Hematopoietic stem cells (HSCs) have self-renewal ability and differentiate into different types of blood cells. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) play a supportive role in hematopoiesis by expressing multiple adhesion molecules, cell-cell and cell-matrix reactions, growth factors and microvesicles (MVs). MVs are released from the various cells, which are different in composition and surface markers. They contain a part of cytoplasmic compositions, such as cytokines, signaling proteins, miRNAs, siRNAs, and mRNAs. The aim of this study was to determine the effect of MSC-MVs on differentiation of umbilical cord blood (UCB) HSCs-CD34+ toward megakaryocytic (MK) lineage.Materials and Methods: In this descriptive study, MSCs were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS. The supernatant was ultracentrifuged for isolation of MVs. HSCs were isolated from the UCB source by MACS method. The purity of CD34+ cells was confirmed by flow cytometry and viability of cells was evaluated by using trypan blue method. HSCs were cultured in an IMDM supplemented with cytokines and MVs in three conditions. The MK differentiation was evaluated by specific markers and specific genes expression after 72 hours. Finally, the data was analyzed by non-parametric t-student test (P<0.05).The specific markers expression of MK lineage (CD41/CD61) in the presence of different concentrations of MSC-MVs did not show significant difference in compared with the control group. Also, specific genes of MK lineage (GATA1, GATA2, FLI1, and c-Mpl), were normalized with GAPDH as an internal control, GATA2 &c-Mpl genes expression were significantly increased, GATA1 gene expression was not significantly decreased and FLI1 gene expression was significantly decreased. The results did not show any significant improvement of MK differentiation in response to synergism effect of MSC-MVs and cytokines