بررسی مكانیسم احتمالی اثرLPG3 لیشمانیا ماژور در فعال كردن لنفوسیت های B خالص شده انسانی ازطریق تحریك TLR2

Abstract

لیشمانیازیس (Leishmaniasis)یکی از مهم ترین بیماری های عفونی است که بوسیله انگل درون سلولی لیشمانیاایجاد می شود.بسته به گونه انگل و شرایط ایمونولوژیکی میزبان، تظاهرات بیماری از زخمهای جلدی مزمن که به صورت خود به خودی بهبود می یابند تا لیشمانیازیس احشایی که در صورت عدم درمان کشنده است متفاوت می باشد.واکسنهای متعددی بر علیه لیشمانیا طراحی و آزمایش شده اند که شامل انگل کشته شده، انگل زنده ضعیف شده،پروتئین های نوترکیب لیشمانیا و DNA واکسنهای کد کننده پروتئین های لیشمانیا می باشد.تا به امروز واکسن موثری بر علیه لیشمانیا معرفی نشده است و تعداد کمی واکسن بر علیه لیشمانیا ساخته شده اند که در مرحله کار آزمایی بالینی قرار دارند.مواد و روشها:در این مطالعه از 10 فرد بالغ نرمال، بدون سابقه ابتلا به بیماری لیشمانیازیس خونگیری صورت گرفت. پس از جداسازی سلولهای تک هسته ای خون (PBMC)، سلولهای B با کمک نانوذرات مغناطیسی جدا گردید وسپس با غلظت های 2، 10 و 20g/ml از پروتئین LPG3 و قطعات آن (N و C ترمینال)، در حضور و عدم حضور آنتی بادی ضد TLR-2 کشت داده شد. در نهایت میزان ترشح و بیان ژن سایتوکاین های (TNF-، IL-10 و IL-6) با روش ELISA و روش Real time PCR و میزان بیان مارکر فعالیتCD69 با روش فلوسایتومتری بررسی شد.یافته ها:نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئین نوترکیب LPG3 و قطعات آن، باعث ترشح سایتوکاین های TNF- و IL-6 از سلول های B می شود اما تاثیری بر روی ترشح IL-10 ندارد.همچنین نشان داده شد که میزان بیان مارکر CD69 فعالیت در سلول های B افزایش می یابد و مشخص گردید که فعال شدن سلول های B مستقل از مسیر سیگنالینگ TLR-2 می باشد., Leishmaniasis is one of the important infectious diseases caused by an obligate intracellular parasite.The clinical manifestation of disease may various from selfhealing chronic cutaneous lesions to progressive and fatal systemic infection, if left untreated. The several vaccination approaches such as whole killed parasites (as a first generation), poly-proteins, recombinant proteins or dendritic cells pulsed with Leishmania-derived peptides (as second generation) and DNA vaccines (as third generation) have recently been developed, however, none of them was sufficient to protect humans against infection.Material and Methods: The heparinized peripheral blood samples were collected from 10 adult healthy volunteers with no history of Leishmania infection after obtaining their informed consent. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by density gradient centrifugation on Ficoll–Paque from whole blood.Purified B cells were co-incubated with recombinant LPG3, NT-LPG3 and CT-LPG3 fragments in the presenc or absence of anti-TLR2 and we evaluated the capability of recombinant Leishmania LPG3 and its fragments in the activation of B cells. We assessed activation of B cells through the production of IL-6, TNF-(as pro-inflammatory cytokines), and IL-10 (as an immune-regulatory cytokine) cytokines and expression of activation CD69 molecule.Results:Our results indicated that recombinant LPG3 stimulates human B cells to secrete pro-inflammatory IL-6 and TNF- cytokines via TLR2 independent signaling pathway and have no stimulatory effect on IL-10 secretion. We found that rLPG3 and its NT fragment have a significant effect on upregulation of CD69 on the surface of purified B cells.