خالص سازی ساب کلاسIgG1 موش و تولید و خالص سازی آنتی بادی پلی کلونال علیه آن در خرگوش

Abstract

آنتی بادی های موشی شامل IgG, IgA, IgM, IgE می باشد. چهار زیر کلاس IgG موشی شاملIgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3شناسایی و توصیف شده اند.اهداف این طرح تخلیص IgG2aموش و تولید و تخلیص آنتی بادی پلیکلونال کونژوگه با آنزیم علیه IgG1 میباشد.مواد و روش ها: کروماتوگرافی تمایلی پروتئین A برای جدا سازی IgG1 موشی مورد استفاده قرار کرفت. بافر سولفات سدیم 1/0 مولار (PH=6) برای تخلیص IgG1 موشی استفاده شد. خلوص IgG1 موشی تخلیص شده توسط آزمون SDS-PAGE تائید شد.سرم خرگوش ایمن شده با IgG1 موشی جدا شده و ایمونوگلوبولین های آن بوسیله آمونیوم سولفات در غلظت نهایی 50 رسوب داده شد.بعد از دیالیز در مقابل بافر تریس-فسفات (PH=8.1) از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی برای تخلیص آنتی بادی خرگوشی تولیدی بر علیه IgG1 موشی استفاده شد. سپس برای کونژوگه کردن آنتی بادی تولیدی با آنزیم HRP از روش پریودات استفاده شد. تیتر کونژوگه تولیدی توسط آزمون الایزای مستقیم تعیین شد.یافته ها: تیتر آنتی بادی خرگوشی تولید شده بر علیه IgG1 موشی توسط آزمون الایزا 64000/1 تعیین شد. خلوص آنتی بادی خرگوشی تولید شده بر علیه IgG1 حدود 95 تعیین شد. تیتر کونژوگه HRP تهیه شده از آنتی بادی خرگوشی تولید شده بر علیه IgG1 نیز 8000/1 بود. این مطالعه نشان داد که کروماتوگرافی تعویض یونی و کروماتوگرافی تمایلی تکنیک های مناسبی برا تخلیص IgG موش و زیر کلاس های آن می باشند., Mice immunoglobulins contain IgG, IgA, IgM and IgE. Four main subclasses of mouse IgG containing IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 have been defined and described.Methods: Sepharose beads conjugated with protein A affinity chromatography was used for purification of mouse IgG1. Sodium phosphate buffer (0.1 M, pH: 6) was used for separation of mouse IgG1. Verification of the purified fractions was monitored by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in reducing condition. Immunized rabbit serum was collected and precipitated at the final concentration of 50% ammonium sulfate. After dialysis against tris-phosphate buffer (pH: 8.1) ion exchange chromatography column was used for purification of rabbit anti-mouse IgG1. The periodate method was performed for conjugation with some variations. After conjugation, direct ELISA was used to determine the titer of HRP conjugated rabbit IgG against mouse IgG1. Results: The titer of rabbit anti-mouse IgG1 that determined by ELISA was 64000. The purity of rabbit anti-mouse IgG1 was about 95%. The optimum dilution of prepared HRP conjugated IgG was 1:10000. This study showed that ion-exchange chromatography and affinity chromatography could be appropriate techniques for purification of mouse IgG and IgG subclasses respectively