تولید و خالص سازی قطعه F(ab')2 از آنتی بادی پلی کلونال خرگوشی ضد IgG انسانی

Abstract

هدف از این مطالعه، بررسی تولید و خالص سازی قطعه F(ab')2 از آنتی بادی پلی کلونال خرگوشی ضد IgG انسانی می باشد.برای تولید آنتی بادی پلی کلونال خرگوشی، آنتی ژن در چهار مرحله به خرگوش تزریق شد.سرم خرگوش جمع آوری شد و با آمونیوم سولفات 50% رسوب داده شد.در همه مراحل غلظت پروتئین به وسیله اسپکتروفتومتری در طول موج 280 نانومتر اندازه گیری گردید. IgG خرگوشی به وسیله کروماتوگرافی تعویض یونی روی ستون سفاروز DEAE خالص سازی شد و برای نمایان شدن آنتی بادی خالص شده روی ژل، ژل با کوماسی بلو رنگ آمیزی گردید. IgG خرگوش با آنزیم پپسین هضم شد، محلول شامل قطعه آنتی بادی برای خالص سازی F(ab´)2از دیگر قطعات تولید شده، به ستون ژل فیلتراسیون اضافه شد.قطعه F(ab´)2 با FITC کونژوگه شد و فعالیت آن به روش فلوسایتومتری با نمونه استاندارد مقایسه گردید.سرم خرگوش در تیتر 128000/1 بیشترین جذب را در واکنش با IgG انسانی در تست الایزای طراحی شده، نشان داد. در SDS-PAGEنمونه حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی، در شرایط غیر احیا فقط یک باند در محدوده وزن مولکولی150کیلودالتون ، و در شرایط احیا دو باند در موقعیت وزن مولکولی50 و 25 کیلودالتون مشاهده شد. این نتیجه خلوص بالای 95% را نشان داد. همچنین SDS-PAGEبرای تعیین خلوص قطعه F(ab´)2در شرایط غیر احیا انجام شد که در آن یک باند در ناحیه 100کیلودالتونمربوط به قطعه F(ab´)2مشاهده گردید, Some published literature have been described the use of enzymes to fragment IgG molecules. Antibodies and antibody fragments are often used in a labeled form. The production of these pure fragments is a consequential step in the development of medical research, treatment and diagnosis towards self-sufficiency of the country. For production of polyclonal antibody rabbit received antigen in four steps. Rabbit serum was collected and precipitated at the final concentration of 50% saturated ammonium sulfate. In all stages the protein concentration determined by UV spectrophotometer at 280 nm. Rabbit IgG was purified by Ion-Exchange Chromatography method on a DEAE-sepharose column. Purity was assessed by SDS-PAGE method and purified antibodies were visualized in the gel by Coomassie Brilliant Blue staining. Rabbit IgG was digested by pepsin enzyme. The antibody fragments solution was applied to Gel filtration column to isolate the F(ab')2. F(ab')2 was conjugated with FITC. The activities of FITC conjugated F(ab')2 fragment and commercial ones were compared using flowcytometry method. The rabbit serum at 1/128000 dilution showed high absorbance in reaction with human IgG at the designed ELISA method. In non-reduced condition only one band was seen in about 150 KDa MW position and in reduced form, two bands were seen in 50 & 25 KDa MW positions. These results demonstrated a purity level of over 95%. Non-reduced SDS-PAGE for determining the purity of F(ab')2 fragment resulted in one band in 100 KDa corresponds to F(ab')2 fragment.