کاربرد روش تکثیر هم دما به واسطه لوپ ( (LAMP و مقایسه آن باPCR استاندارد در تشخیص انگل لیشمانیا در پشه خاکی

Abstract

لیشمانیوز توسط تك یاخته اجباری داخل سلولی از جنس لیشمانیا ایجاد می شود و به اشکال جلدی، زیر جلدی و احشایی وجود دارد. لیشمانیوز جلدی در کشور ما به فرم شهری و روستایی وجود دارد که بترتیب بوسیله لیشمانیا تروپیکا و لیشمانیا ماژور ایجاد می شود. انگل لیشمانیا توسط گونه های مختلف پشه خاکی منتقل می گردد.یکی از اقدامات اساسی در بررسی وضعیت اپیدمیولوژیک بیماری، بررسی آلودگی پشه خاکی به انگل لیشمانیا می باشد که در گذشته از روش های میکروسکوپی و ایزوآنزیم استفاده می شد. ولی در حال حاضر روش های مولکولی نظیر PCR،Nested PCR ، Real Time PCR از حساسیت و ویژگی بالایی برخوردارند و بیشتر مورد توجه محققین قرار گرفتند. هدف از این مطالعه بررسی بار انگلی لیشمانیا در پشه خاکی با تکنیک (LAMP) است.مواد و روش ها: در این مطالعه تعداد 150 نمونه پشه خاکی ماده به روش های مختلف از شهر ها و روستاهای مختلف استان خوزستان جمع آوری شدند. پس از تشریح پشه های خاکی ماده به منظور تشخیص جنس و گونه، DNA انگل لیشمانیا از پشه های خاکی آلوده مشکوک استخراج گردید. تکنیک PCR و LAMP به منظور شناسایی آلودگی طبیعی بکار گرفته شد. همچنین جهت شناسایی حساسیت روش های اشاره شده، از انگل لیشمانیا ماژور کشت داده شده از 101 تا 106 رقت سازی تهیه شد.یافته ها در این مطالعه از مجموع 150 پشه خاکی ماده مورد بررسی، 5 گونه از جنس های فلبوتوموس و سرژنتومیا تشخیص داده شده اند. در بررسی مولکولی و بررسی وضعیت آلودگی پشه های خاکی با استفاده از روش PCR، 4% و با استفاده از روش LAMP ، 6.6% آلوده به انگل لیشمانیا ماژور شناسایی شدند. .حساسیت آنالیزی محیط کشت نشان داد که LAMP می تواند 101 تا 106 پروماستیگوت لیشمانیا ماژور را در 100میکرولیتر محلول RPMI1640 شناسایی کند، درحالیکه 104 تا 106 پروماستیگوت با PCR شناسایی شد., Leishmaniasis caused by an intracellular protozoan from species of Leishmania that cause cutaneouse, sub cutaneouse and veisceral leishmaniasis. Cutaneouse leishmaniasis is in dry and wet form in Iran that cause by L. tropica and L. major respectively. Leishmania species are transporte by sand flies and microscopic and molecular test are neede to evaluate the paprasites in vectors. Nodays, molecular tests such as conventional PCR, Nested PCR and Real Time PCR are very sensitive and are in attention by scientists. This study is aimed to evaluate the leishmania Parasite load in sand flies by LAMP technique.Materials and methods:In current work 150 sandflies are collected from different districts of Khuzestan Province, Iran. After describing the female sand flies in order to identify species, DNA from Leishmania-infected sand flies were extracted suspect. PCR and LAMP technique was used to identify natural infection. Also for sensitive detection methods are mentioned, of Leishmania major cultivated from 101 to 106 dilution was preparedResults:In 150 collected sandflies, 5 species of Phlebetemus and Sergentomia are diagnosed. In molecular methods, 4% were positive by PCR and 6.6% were positive by LAMP technique. All species of leishmania were diagnosed as L. major. The analytical sensitivity findings of In vitro culture showed that LAMP can identify 101-106 promastigotes/100µl RPMI 1640 in L. major infections while PCR recognized 104-106 parasites