شناسایی آنتامبا هیستولیتیکا ، آنتامبا دیسپار و آنتامبا موشکوفسکی در نمونه های مدفوع مراجعه کننده به بیمارستان امام خمینی شهرستان سقز با روش مولتی پلکس پی سی آر

Abstract

آمیبیازیس یک مشکل بهداشت عمومی در بسیاری از نواحی جهان می باشدکه توسط تک‌ یاخته‌ایی به نام آنتامبا هیستولیتیکا ایجاد میشود، شناسایی آمیبیازیس در آزمایشگاه های کشور به روش میکروسکوپی که فاقد توانایی در افتراق بین گونه‌های بیماریزا از غیر بیماریزا است صورت گرفته وباتوجه به وجود گزارشات موارد اسهال خونی در شهرستان سقز مطالعه‌ای جامع در این زمینه انجام نشده لذا درمطالعه حاضر از روش مولتی پلکس PCR استفاده شدکه نه تنها توانایی شناسایی وافتراق گونه‌های آمیب را بطور هم زمان در یک واکنش تک مرحله‌ایی را دارد بلکه قادر می‌سازد در زمان و هزینه کمتربه تشخیص ودرمان صحیح از بیماری در منطقه برسیم. مواد وروش کار: 500 نمونه مدفوع از بهمن ماه 1392 تا تیر ماه 1394 از بیماران با علائم گوارشی شهرستان سقز واقع در شمال غرب ایران جمع‌آوری گردید. پس از مشاهدات میکروسکوپی و رنگ آمیزی تری کروم، DNA نمونه‌های تایید شده استخراج و به منظور تشخیص جنس آمیب به روش PCR تک مرحله‌ای با هدف قرار دادن ژن 18S rRNA تکثیر شدند. جهت تشخیص گونه آمیب‌های شناسایی شده از روش مولتی پلکس PCR استفاده شد. برای تایید قطعی و بررسی ویژگیهای هتروژنیسیتی، تمام آمپلیکون‌ها تعیین توالی و با آنالیزهای فیلوژنتیک بررسی شدند. همچنین به منظور مقایسه توالیهای آنتامبا هیستولیتیکا با ایزوله‌های کشورهای همسایه، توالیهای کشور عراق بطور مستقیم از بانک جهانی ژن دریافت شدند.نتایج: از 500 نمونه مدفوع با مشاهدات میکروسکوپی مستقیم تعداد 80 نمونه‌ آلوده به آمیب شناسایی شده و جهت تعیین جنس با روش تک مرحله‌ایی PCR تعداد 18 نمونه (6/3درصد) آمیب شناسایی شد. نتایج مولتی پلکس PCR و تعیین توالی نشان داد که 2/2 درصد آنتامبا هیستولیتیکا و 1 درصد آنتامبا موشکوفسکی و 4/0 درصد آنتامبا دیسپار بودند. لازم به ذکر است که دریکی از نمونه‌های مدفوع مبتلایان به اسهال خونی گونه آنتامبا موشکوفسکی مشاهده شد. در بررسیهای تعیین توالی در نمونه اسهال‌های خونی آنتامبا هیستولیتیکا و آنتامبا موشکوفسکی بترتیب 2 و 1 هاپلوتایپ جدید شناسایی شدند. مقایسه توالی شهرستان سقز با کشور عراق نشان داد که این دو جمعیت از نظر ساختار ژنتیکی آنتامبا هیستولیتیکا تفاوتی آشکار با یکدیگر ندارند, Amoebiasis is one of the public health problems in all over the world that cause by protozoan parasite, Entamoeba histolytica. Detection of amoebiasis in laboratories is based on microscopic methods that unable to distinguish between pathogens and non-pathogens species of Entamoeba. Due to the reports of dysentries cases in Saghaez city, there is not any comprehensive studies in this area, So this study was aimed to differentiation between the species of Entamoeba by Multiplex PCR that able to detect different species by low cost and minimum time with single step PCR reaction.Materials and Methods: During January 2015 to January 2016, 500 fecal samples were collected from suspected patients in Saghez city, northern west of Iran. After Parasitological examinations and trichrome staining method, DNA was extracted and single-step PCR was done on 18s RNA gene to identification of the genus of Entamoeba. To identify the Entamoeba spp., the multiplex PCR was used. To reconfirm, the amplicons were sequenced to prove the results of PCR and for heterogeneity. Additionally for comparison to Iraq isolates, sequence were received directly from GeneBank database.Results: 80 out of 500 fecal samples were suspected to Entamoeba spp. by microscopic observation. 18 samples (3.6%) were positive by microscopic and PCR technique. The results of multiplex PCR was shown that, 2.2% of isolates was E. histolytica, 1% was E. moshkovskii and 0.4% was E. dispar. It's noteworthy that in one amebic dysentery, E. moshkovskii was detected and in sequencing, 2 novel haplotypes of E. histolytica and one haplotype of E. moshkovskii were identied. Additionally, there were not any significant genetic differences between the populations of Saghez city and Iraq countries.