تاثیر قطعه نوترکیب Hcc زنجیره سنگین توکسین کزاز بر روی لنفوسیت های T خالص شده انسانی به عنوان کاندیدی برای واکسیناسیون

Abstract

پاسخ مصونیت زا علیه توکسین تتانوس و توکسوئید آن نیازمند پاسخ های کارآمد سلول های B و سلول هایT اختصاصی است. نوروتوکسین کلستریدیوم تتانی ((TeNT ، یک پلی پپتید 150 کیلودالتونی است، که عامل اصلی بیماری کزاز می باشد. نوروتوکسین کلستریدیوم تتانی از دو زنجیره، یک زنجیره سبک 50 کیلودالتونی در ناحیه N ترمینال و یک زنجیره سنگین 100 کیلودالتونی در ناحیه C ترمینال تشکیل شده است. ناحیه C ترمینال زنجیره سنگین (فراگمنت C) دارای دو ساب دومن پروکسیمال HCN و ساب دومن کربوکسی یا Hcc می باشد. اتصال و ترانس لوکاسیون توکسین نقش دارد. ساب دومین HCC فراگمنت C که نقش اصلی را در اتصال توکسین کزاز به گیرنده هایش در سطح سلول های نورونی دارد، اخیرا به عنوان ناحیه ایمونودومیننت نوروتوکسین تتانی شناخته شده است. در این مطالعه، ما تاثیر پروتئین نوتركیب Hcc بر میزان بیان ژن فاكتورهای رونویسی اختصاصی و ترشح گروهی از سایتوکاین های عملکردی از جملهIFN- ، IL-4 و IL-17A بر سلول های T خالص شده انسانی را بررسی کردیم. نتایج ما نشان داد میزان بیان فاکتور رونویسی T-bet به عنوان فاکتور رونویسی اختصاصی رده TH1 ، در سلول های تیمار شده با غلظت های 10 و 20 g/ml از rHcc به مدت 48 ساعت به طور معنی داری افزایش داشت (p<0.05). در لنفوسیت های T انسانی تیمار شده با rHcc به مدت 48 ساعت میزان بیان mRNA و میزان ترشح IFN- به طور معنی داری افزایش داشت ولی در میزان بیان و ترشح IL-4 و IL-17A افزایش نداشت.روش کار و مواد: در این پژوهش از 10 فرد بالغ سالم که سابقه کزاز نداشتند و با اخذ رضایت نامه از آنها خون هپارینه گرفته شد. سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMC) با استفاده از فایکول و ایجاد گرادیان چگالی با سانترفیوژ جدا شدند. لنفوسیت های T به کمک نانوذرات مغناطیسی جدا شد. لنفوسیت های T خالص شده با پروتئین نوترکیب Hcc کشت داده شدند. سپس میزان بیان ژن فاکتورهای رونویسی (T-bet، GATA3 و RORT) و سایتوکاین های (IFN-، IL-4 و IL-17A) به روش Real time PCR و میزان ترشح سایتوکاین های مذکور به روش ELISA مورد بررسی قرارگرفت. هم چنین توانایی قطعه نوترکیب Hcc در فعال سازی سلول های T با میزان بیان CD69 بررسی شد.یافته ها: نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئین نوترکیب Hcc باعث بیان افزایش یافته CD69 بر سطح سلول های T شده و سبب القای تمایز لنفوسیت های T CD4+ به سمت فنوتیپ T کمکی 1 (Th1) و افزایش ترشح IFN- می شود. , A protective response against tetanus toxin and toxoid demands efficient specific T cell and B cell responses. Tetanus neurotoxin (TeNT), a 150 kDa polypeptide, is the main cause of tetanus disease. TeNT consists of two structurally distinct chains, a 50 kDa N-terminal light (L) and a 100 kDa C-terminal heavy (H) chain. C-terminal heavy (H) chain (fragment C) has two sub-domains named as proximal HCN and carboxy sub-domain or HCC. Beside neural binding property, HCC has been recently found as an immunodominant module of TeNT. In the present study, we investigated the effects of recombinant HCC (rHCC) on the expression of lineage specific transcription factors and secretion of a panel of functional cytokines including IFN-, IL-4, and IL-17 from purified human T cells. Our results revealed that T-bet transcript level, as TH1 specific transcription factor, was significantly increased in the cells treated with 10 and 20 µg/ml of rHCC following 48 h treatment (p<0.05). Treated purified human T cells with rHCC showed significant increase in IFN- mRNA level and cytokine secretion, but not IL-4 and IL-17, following 48 h treatment. In conclusion, our results showed that treatment of T cells with r HCC resulted in development of Th1 lineage phenotype, which might lead to a specific and protective antibody mediated response against tetanus toxin. Material and Methods: The heparinized peripheral blood samples were collected from 10 adult healthy volunteers with no history of tetanus after obtaining their informed consent. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by density gradient centrifugation on Ficoll–Paque from whole blood. T cells were isolated by MACS. Purified T cells were co-incubated with recombinant Hcc. Then, we evaluated the expression level of transcription factors (T-bet, GATA3 and RORT), the expression and secretion of cytokines (IFN-, IL-4 and IL-17A) using Real-time PCR and ELISA. The capability of recombinant Hcc fragments in the activation of T cells was assessed by CD69 expression.Results: The results showed that rHcc enhanced expression of CD69 on the surface of T-cells and promoted differentiation of CD4+ T-lymphocytes toward a T-helper1 (TH1) phenotype and up-regulation of interferon (IFN)- secretion.