خالص سازی ساب کلاس IgG2b موش و تولید و خالص سازی آنتی بادی پلی کلونال علیه آن در خرگوش

Abstract

آنتی بادی ها (ایمونوگلوبولین ها) پروتئینهای در گردش خون هستند كه در پاسخ به آنتی ژنهای خارجی تولید می شوند. ایمونوگلوبولین های موش شامل IgG، IgA، IgM و IgE می باشند. چهار زیركلاس اصلی IgG موش شامل IgG1، IgG2a، IgG2b و IgG3 می باشند كه از لحاظ ایمونولوژیكی و فیزیكوشیمیایی تعریف و شرح داده شده اند.مواد و روشها: کروماتوگرافی تمایلی حاوی پروتئینA متصل به ذرات سفاروز برای خالص سازیIgG2b موشی استفاده شد. پروتئینA استافیلوکوکوس اورئوس گیرندهFC باکتریایی است که به IgG متصل می شود.بافر سدیم سیترات (1/0 مولارpH=3.5 ) برای جداسازیIgG2b موش استفاده شد. پس از تخلیصIgG2b موشی، تائیدفراکشن خالص سازی شده توسطSDS-PAGE(پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز) در شرایط احیامشاهده شد. سرم خرگوش ایمن شده باIgG2b جمع آوری شد و در غلظت نهایی آمونیوم سولفات 50% رسوب داده شد. بعد از دیالیز در برابر بافر تریس فسفات (pH=8.2)،برای خالص سازی آنتی بادی خرگوشی علیهIgG2b موش کروماتوگرافی تعویضیونیاستفاده شد. روش پریوداتبرای کونژوگه کردن آنتی بادی خرگوشی علیه IgG2bانجام شد. سپس، از روش الایزای مستقیم برای تعیین تیترآنتی بادی پلی کلونال خرگوشی کونژوگه شده با HRP علیهIgG2b موش استفاده شد.یافته ها: پس از آغاز خالص سازی IgG2b موش،خلوص فراکشن شستشو شده با روشSDS-PAGE بررسی شد. خلوص فراکشن بالای 90% بود. تیتر آنتی بادی خرگوشی علیه IgG2b موش با استفاده از تکنیک الایزا 32000 تعیین گردید. خلوص این آنتی بادی با استفاده از SDS-PAGE در شرایط احیا حدود 95% تعیین شد. رقت بهینه IgG کونژوگه شده با HRP 1:10000محاسبه گردید., Antibodies (or immunoglobulins) are circulating proteins that are produced in response to exposure to foreign antigens.Mice immunoglobulins contain IgG, IgA, IgM and IgE. Four major subclasses of mouse IgG containing IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 have been defined and described, both physiochemically and immunologicallyMaterials and Methods: Sepharose beads conjugated with protein A affinity chromatography was used for purification of mouse IgG2b. Protein A from Staphylococcus aureus has bacterial Fc (or fragment crystalline) receptor which bind to IgG. Sodium citrate buffer (0.1 M, pH= 3.5) was used for separation of mouse IgG2b. After purification of mouse IgG2b,verification of the purified fractions was monitored by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) in reducing condition. Immunized rabbit serum with IgG2b was collected and precipitated at the final concentration of 50% ammonium sulfate. After dialysis against tris-phosphate buffer (pH=8.2), ion exchange chromatography was used for purification of rabbit anti-mouse IgG2b. The periodate method was performed for conjugation of purified rabbit anti-mouse IgG2b. Then, direct ELISA was used to determine the titer of HRP conjugated rabbit polyclonal antibody against mouse IgG2b.Results:After initial purification of mouse IgG2b, the purity ofthe eluted fraction was analyzed by SDS-PAGE. The purity of thefraction was up to 90%. The titer of rabbit anti-mouse IgG2b that determined by ELISA was 32000. The purity of rabbit anti-mouse IgG2b was about 95%. The optimum dilution of prepared HRP conjugated IgG was 1:10000.