کلونینگ و بیان ژن cDNA فاکتور رشداپیدرمال انسانی به داخل مخمر Pichia pastoris

Abstract

In this study, a secretive plasmid (pPIC9) was used, which contains potent regulatory elements such as AOX promoter and -mating factor(-MF) leader sequence for efficient expression and secretion of recombinant proteins into extracellular milieu. EGF cDNA was purchased from Gencopeia company and amplified by PCR with desired primers, then PCR product and vector digested by two restriction enzyme, ECoRI and XhoI,.The digested fragment was ligated with T4 DNA ligase.For confirmation of ligation, sequencing of recombinant vector was carry out . Sequencing of DNA indicated that EGF gene consist of 159bp for encoding of protein with molecular weight of about 6.3kDa.Indeed EGF protein was not expressed in pPIC9 vector., در این مطالعه، پلاسمید pPIC9 که حاوی عناصر تنظیمی موثر از قبیل پروموتر AOX وتوالی راهنمای -MF جهت بیان موثر و ترشح پروتئین به محیط خارج سلولی مورد استفاده قرار گرفت.cDNA ژن EGF از شرکت Gencopeia خریداری گردید و با پرایمرهای اختصاصی تکثیر داده شد، سپس محصول PCR و وکتور توسط دو آنزیم محدودالاثر،EcoRI و XhoI، دایجست شدند. قطعات دایجست شده با T4 DNA لیگاز به هم متصل شدند. برای تائید عمل Ligation ، وکتور نوترکیب تعیین توالی شد.تعیین توالی DNA مشخص کرد ژن EGF حاوی 159 جفت باز بوده که کد کننده پروتئینی با وزن مولکولی 3/6 کیلو دالتون می باشد. در ضمن پروتئین EGF در وکتور pPIC9 بیان نگردید.