کلون کردن و بیان پایدار مارکر لنفوسیتهای B (CD19) در لاین سلولی NIH-3T3 موشی

Abstract

Objectives: The aim of this study was cloning of cDNA coding for human CD19 and produce a mouse cell line stably expresses human CD19 molecule to prepare an appropriate immunogen as first step in antibody production during future experiments. Methods & Materials: Total RNA was extracted from Raji cells in which expression of CD19 was confirmed by flow cytometry. Then, cDNA was synthesized and used for CD19 gene amplification by PCR using Pfu DNA polymerase. PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector, ligation mixture was transformed to DH5 competent bacteria. Screened white colonies by blue/white selection method were subjected to colony-PCR reactions using gene-specific primers and plasmid from a single positive colony was exteracted and sequenced. Then, CD19 coding sequence was sub-cloned into pCMV6-Neo expression vector by double digestion using KpnI and HindIII enzymes. Obtained construct was subsequently transfected to NIH-3T3 mouse fibroblast cell line using Jet-PEI transfection reagent. After 48 hours, surface expression of CD19 on transfected NIH-3T3 cells was evaluated by flow cytometry. Then, stably-transfected cells expressing CD19 were selected by increasing concentrations of G418 antibiotic to culture medium. Results: Amplification of CD19 cDNA gave rise to 1701 bp amplicon confirmed by alignment to reference sequence in NCBI database. Flow cytometry analysis indicated that CD19 molecule was successfully expressed on NIH-3T3 cells, هدف: هدف از این مطالعه کلونکردن cDNA کدکنندهی CD19 انسانی و ایجاد یک لاین سلولی موشی دارای بیان پایدار مولکول CD19 برای تهیه ایمونوژن مناسب بعنوان اولین گام در تولید آنتیبادی در طی طرحهای آتی بود. روش کار و مواد: RNA تام از سلولهای Raji پس از تأیید بیان CD19 با تکنیک فلوسیتومتری استخراج گردید. سپس cDNA سنتز شد و برای تکثیر ژن CD19 به روش PCR با آنزیمPfu مورد استفاده قرار گرفت. محصول PCR با وکتورpGEM-T Easy ترکیب گردید و مخلوط الحاق به باکتریهای مستعد DH5 ترانسفورم شد. بر روی کلنیهای سفید غربال شده به روش گزینش آبی-سفید، واکنش کلنی-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن صورت گرفت و پلاسمید یک کلنی مثبت استخراج گردید و تعیین توالی شد. سپس توالی کدکنندهی CD19 به روش برش دو آنزیمی با استفاده از آنزیمهای KpnI و HindIII در وکتور بیانی pCMV6-Neo ساب کلون شد. کانستراکت حاصل پس از بررسی صحت توالی و با استفاده از ماده JetPEI به سلول NIH-3T3 ترانسفکت گردید. پس از 48 ساعت، بیان سطحی CD19 در سلولهای ترانسفکت شده با استفاده از فلوسیتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس سلولهای ترانسفکت شدهی دارای بیان پایدار CD19 با افزودن آنتیبیوتیک G418 در غلظتهای افزاینده به محیط کشت انتخاب شدند. یافتهها: تکثیر ژن CD19 منجر به قطعهای به طول bp 1701 شد که در قیاس با توالی مرجع در بانک اطلاعاتی NCBI مورد تأیید قرار گرفت. نتایج فلوسیتومتری نشان از بیان موفقیتآمیز CD19 بر سطح سلولهای NIH-3T3 داشت