کلون وبیان فاکتور سلول بنیادی انسانی نوترکیب در باکتری E.coli

Abstract

The objective of this study was cloning and expression of rhSCF in E.coli. Method and materials: Human soluble SCF ORF was amplified by PCR using specific primers containing Nco and Xho sites. In the next phase, pET-26b(+) vector and amplified SCF ORF were digested by the Xho1 and the Nco1 enzymes then were electrophoresed and the desired fragments were recovered from the gel. The fragment was ligated to the pET-26b(+) vector using the T4 ligase enzyme. The ligation product was transformed into competent E. coli DH5 and transformants were selected on LB agar plates containing kanamycin. The selected clones were further analyzed by PCR and sequencing. For expression, the recombinant plasmid, pET-26b(+)/hSCF, was transformed into competent E.coli BL21(DE3) bacteria. The Ecoli BL21(DE3) cells harboring expression vector pET-26b(+)/hSCF were cultured in LB medium and were induced for expression of the recombinant proteins using IPTG. Subsequently SDS-PAGE experiment was performed for survey of the protein expression. Results: In this study, existence of insert (human soluble SCF ORF) in the recombinant vector (pET-26b(+) /hSCF), was detected by PCR and finally the identity and orientation of hSCF in the construct were confirmed by DNA sequencing. Evaluation of rhSCF protein expression using SDS-PAGE showed that the protein is not expressed. , هدف از این طرح، کلون و بیان SCF انسانی نوترکیب، در باکتری E.coli میصباشد.مواد وروش ها: ORF ژن SCF انسانی محلول به وسیله پرایمرهای اختصاصی محتوی محل برش آنزیم Xho و Ncoبا استفاده از روش PCR تکثیر داده شد. در مرحله بعدی، وکتور pET-26b(+) و ORF ژن SCF تکثیر داده شده، به وسیله آنریم‌صهایXho وNco برش داده شد، سپس الکتروفورز شده و قطعه های مورد نظر از ژل آگاروز خالص سازی شد. سپس به وسیله آنزیم T4 لیگاز عمل اتصال ORF ژن SCF به وکتور pET-26b(+) انجام شد. محصول ligation به باکتری DH5 ترانسفورم شد و transformants در روی پلیت آگار حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین غربال شدند. کلونیصهای انتخاب شده، بوسیله آزمایشPCR و تعیین توالی آنالیز شد. برای بیان، وکتور نوترکیب pET-26b(+)/rhSCF به داخل باکتری BL21(DE3)، ترانسفورم شد. جهت بیان پروتئینrhSCF، باکتری محتوی وکتور نوترکیب در داخل محیط LB کشت داده شد و بوسیله IPTG، باکتری القاء گردید. در نهایت جهت بررسی بیان پروتئین نوترکیب، آزمایش SDS-PAGE انجام شد.نتایج: دراین مطالعه، وجود ORF ژنSCF در داخل وکتور نوترکیب با استفاده از PCR تشخیص داده شد، در نهایت همخوانی و جهت قرار گیری ORF ژن SCF انسانی در داخل وکتور نوترکیب به وسیله تعیین توالی وکتور نوترکیب تایید شد. بررسی بیان پروتئین با استفاده از SDS-PAGE نشان داد که پروتئین rhSCF بیان نشده است.