تولید آنتی بادی مونوکلونال بر علیه مارکر CD20 در سطح لنفوسیت های B و ارزیابی اتصال اختصاصی آن به سلولهای بیان کننده CD20

Abstract

Objective: The prime aim of this study was to produce monoclonal antibody against CD20 and evaluation of specific binding to CD20 expressed cells. METHODS: First, Balb/c mice were immunized with peptide from extracellular domain of CD20. Spleen cells of the most immune mouse were fused with SP2/0 (myeloma cells) by Poly Ethylene Glycol (PEG). Supernatant of hybridoma cells were screened for detection of antibody by ELISA. The desired clones were selected for limiting dilution (L.D). Large scale of monoclonal antibodies was produced by ascetic fluid method. Monoclonal antibody was purified by Protein-A-Sepharose column affinity chromatography then confirmed by SDS-PAGE. Afterward, evaluation of specific binding of these antibodies was determined by immunological assay such as ELISA and Immunofluorescence and flow cytometry. RESULTS: between 3 positive clone wells, one clone was chosen for limiting dilution. Limiting dilution product was one monoclone with absorbance about 2. Protein-A-Sepharose column affinity chromatography yielded about 4 mg of purified monoclonal antibody. The SDS-PAGE results confirmed purification of antibody. The result of ELISA, Direct Immunofluorescence Staining and flow cytometry confirmed specific attachment to CD20. , هدف : هدف اصلی این مطالعه تولید آنتی بادی مونوکلونال بر علیه مارکر CD20 و ارزیابی اتصال اختصاصی این مارکر در سلولهای بیان کننده CD20 می باشد.روش کار و مواد :ابتدا موشها با پپتید خارج سلولی CD20ایمونیزه گردیدندو سپس فیوژن سلولهای طحال ایمن ترین موش با سلولهای میلومایی SP2/0بوسیله PEG صورت گرفت. سوپرناتانت سلولهای هیبریدوما بوسیله Elisa جهت حضور آنتی بادی غربال شدند.کلون مطلوب برای limiting dilution انتخاب گردید. تولید انبوه انتی بادی مونوکلونال به روش مایع آسیت صورت گرفت. .تخلیص آنتی بادی مونوکلونال با روش افینیتی کروماتوگرافی پروتئین Aانجام شد و با SDS-PAGE نیز تایید صورت گرفت. اتصال اختصاصی آنتی بادی با ارزیابی های ایمونولوژیکی مثل الایزا و ایمونوفلورسانس و فلوسایتومتری صورت گرفت. یافته ها : از بین 3 کلون بدست آمده در فیوژن یک کلون برای Limiting dilution انتخاب گردید. پس از Limiting dilution یک کلون مطلوب با جذب حدود 2 بدست آمد. با تخلیص مایع آسیت با افینیتی کروماتوگرافی پروتئین A mg , 4 آنتی بادی بدست آمد..نتایج SDS-PAGE خلوص محصول کروماتوگرافی را تایید نمود. نتایج الایزا و ایمونوفلورسانس و فلوسایتومتری اتصال اختصاصی به CD20 را نیز تایید نمود.