طراحی و ساخت وکتور بیانی نوترکیب pPIC9حاوی ORF ژن SCF انسانی

Abstract

The Purpose of this study is cloning of soluble form of human SCF cDNA into pPIC9 expression vector and transforming of recombinant vector into the pichia pastoris. The soluble form of the human SCF cDNA was purchased from Gencopeia Incorporation. SCF cDNA was amplified by PCR pursued by double digestion with Xho1/EcoR1 restriction enzymes. In addition pPIC9 vector was digested with these two enzymes. Ligation between the digested SCF cDNA and digested vector was carried out. Ligation of the insert fragment was confirmed by sequencing and recombinant vector was transformed into Pichia pastoris. The first phase of this research was composed of amplification of SCF cDNA by PCR. In the amplified fragment, restriction recognition sites for the Xho1 and EcoR1 enzymes was introduced by embedding it in the forward and reverse primers. After word, SCF cDNA and expression vector were digested with the mentioned restriction enzymes and following digestion, ligation was performed. Recombinant vector rSCF/pPIC9 was selected and verified by plating on LB Agar medium containing ampicillin. Analysis of selected colonies by colony PCR showed entrance of SCF cDNA into the vector. Following linearization of the recombinant vector (hSCF/pPIC9) by Sal1 enzyme, the transformation of the linear vector was performed into the yeast. This phase of project was not successful., هدف این مطالعه کلون کردنcDNA فرم محلول SCF انسانی در وکتور بیانی pPIC9 وسپس ترانسفورم به داخل مخمر Pichia.pastoris میصباشد.cDNA فرم محلول ژن SCF انسانی از شرکت Gencopeia خریداری شد. cDNA SCF با PCR تکثیر داده شد و سپس با دو آنزیم محدودالاثر EcoRI و XhoI برش داده شد و همچنین وکتور pPIC9 نیزبا دو آنزیم فوق برش داده شد. سپس عمل Ligation بین قطعه SCF و وکتور برش داده شده انجام شد. بعد از تائید Ligation با تعیین توالی قطعه insert شده، وکتور نوترکیب را به مخمر Pichia pastoris ترانسفورم نمودیم.مرحله نخست این پژوهش شامل تکثیر قطعه cDNA فرم محلول SCF انسانی، به وسیله PCR بود. در این قطعه تکثیر شده محل‌صهای برش برای آنزیم‌صهای Xho1 وEcoR1 بواسطه تعبیه این محل ها در پرایمرهایForward و Reverse، وجود داشت. در مرحله بعد برش وکتور بیانی و ژن SCF با آنزیم های محدودالاثر ذکر شده صورت گرفت سپس بدنبال آن ligation انجام شد. پس از آن وکتور نوترکیب به داخل باکتری E.coli سوش DH5- ترانسفورم گردید از محیط LB Agar حاوی آمپیصسیلین برای شناسایی کلنی های حاوی وکتور نوترکیب استفاده شد. پس از انتخاب کلنی از PCR برای تایید ورود cDNA SCF به داخل وکتور استفاده گردید. سپس وکتور نوترکیب برای ترانسفورم در مخمر pichia pastoris مهیا گردید. بعد از خطی نمودن وکتور نوترکیب به وسیله آنزیم Sal 1 ترانسفورم این وکتور خطی شده به داخل مخمر انجام شد. این قسمت از پروژه موفقیتی در پی نداشت.