کلون و بیان دمین N-ترمینال (NTD) گلیکوپروتئین اسپایک ویروس SARS-CoV-2 و ارزیابی واکنش آن با سرم بیماران مبتلا به کوید-19

Abstract

پاندمی بیماری COVID-19 چالش‌های جدی و کم‌نظیری را از منظر اجتماعی، اقتصادی و سلامت عمومی برای جهان ایجاد کرد. عامل COVID-19 یک عضو جدید از خانواده کروناویریده و توسط کارگروه بین‌المللی تاکسونومی ویروس‌ها تحت عنوان SARS-CoV-2 خوانده شد. ویروس به ‌سرعت و پایدار در سراسر جهان گسترش یافت و تا اوت سال ۲۰۲۰ بالای بیست و یک میلیون مبتلا و بیش از ۷۵۰۰۰۰ نفر فوتی در جهان برجای گذاشت (طبق اطلاعات WHO این رقم تا اوت ۲۰۲۴ به ترتیب به بیش از ۷۷۵ میلیون مبتلا و بیش از هفت میلیون فوتی رسیده است). در حال حاضر هرچند این بیماری از وضعیت پاندمی خارج شده ولی اپیدمی‌های کوچک و بزرگ آن در کشورهای مختلف رخ داده و با توجه به فرکانس بالای موتاسیون‌های ژنتیکی، خطر جهانگیر این بیماری هنوز کاملاً برطرف نشده است. لذا توسعه روش‌های تشخیص سریع و موثر هنوز از اولویت‌های تشخیص و پیشگیری این عفونت محسوب می‌شود. بحث این مطالعه با هدف ایجاد یک آزمایش تشخیصی جدید مبتنی بر الایزا برای عفونت SARS-CoV-2 با هدف قرار دادن دامنه N ترمینال (NTD) گلیکوپروتئین S انجام شد. با وجود در دسترس بودن واکسن ها، تشخیص زودهنگام برای جلوگیری از انتقال بیماری بسیار مهم است. روش‌های تشخیصی فعلی، مانند qRT-PCR، از نظر در دسترس بودن تجهیزات و نرخ منفی کاذب با محدودیت‌هایی روبرو هستند. تکنیک‌های سرولوژیکی با شناسایی آنتی‌بادی‌های خاص علیه ویروس، جایگزین امیدوارکننده‌ای است. ناحیه NTD گلیکوپروتئین S به عنوان یک هدف کلیدی برای تولید آنتی بادی شناسایی شده است. با بیان و خالص‌سازی NTD نوترکیب، ما یک روش الایزا را توسعه دادیم که حساسیت و ویژگی بالایی را در تشخیص آنتی‌بادی‌های SARS-CoV-2 در سرم بیماران نشان داد. یافته‌های ما نشان می‌دهد که این ELISA مبتنی بر NTD می‌تواند ابزار ارزشمندی برای بهبود تشخیص SARS-CoV-2 باشد. هدف هدف از این پژوهش شناسایی، کلون و بیان اپیتوپ‌های خطی ناحیه‌ی NTD پروتئین اسپایک ویروس SARS-CoV-2 در E. coli و ارزیابی واکنش آن با سرم بیماران است. روش کار ابتدا اپیتوپ‌های خطی ناحیه N-terminal پروتئین S با نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی شناسایی و برای آن طراحی پرایمر انجام گرفت. سپس با استفاده از کیت سنتز cDNA از روی RNA ویروس، سنتز cDNA انجام گرفت و ناحیه‌ی مورد نظر با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر و در وکتور بیانی pET-22b کلون گردید. این سازه پس از تأیید با سکانسینگ، در E. coli ترانسفرم و بیان گردیده و سپس پروتئین نوترکیب استخراج و تخلیص شد. NTD نوترکیب تخلیص شده در پلیت الایزا کوت گردیده و واکنش آن با سرم بیماران، به واسطه تکنیک الایزای غیرمستقیم، بررسی گردید. نتایج ارزیابی با نرم‌افزارهای بیوانفورماتیکی منجر به شناسایی اپیتوپ خطی متعدد در ناحیه N-terminal پروتئین S گردید. تکثیر این ناحیه از روی cDNA ویروس با PCR منجر به تکثیر قطعه ۶۳۳ جفت بازی شد که در وکتور pET-22b و با روش هضم آنزیمی کلون گردیده و با سکانسینگ تأیید گردید. بیان ژن هدف در E. coli منجر به تولید پروتئین نوترکیب NTD با بیان بالا گردید که در آنالیز SDS-PAGE با وزن مولکولی ۲۵ کیلودالتون مشخص گردید. برای ارزیابی واکنش اپیتوپ‌ها با سرم بیماران از روش الایزای غیرمستقیم استفاده شد. پروتئین نوترکیب با رقت ۱:۴۰ در ته چاهک پلیت الایزا کوت گردید و سپس با سرم‌های مثبت و منفی افرادی که با RT-PCR ابتلا آنها به کووید-۱۹ تأیید شده بودند، مجاور گردیدند. از میان ۵۰ بیمار در گروه RT-PCR مثبت، ۴۴ بیمار در الایزا مثبت شدند، درحالی‌که از گروه RT-PCR منفی، ۴۸ بیمار در تست الایزا منفی گردیدند. لذا حساسیت و ویژگی آزمایش الایزا برای تشخیص آنتی‌بادی SARS-CoV-2 (IgG) در بیماران مبتلا به کووید-۱۹ تأیید شده، به ترتیب ۹۶ و 88 درصد تعیین گردید. واژگان کلیدی اپیتوپ، NTD، موتاسیون، SARS-CoV-2، کووید-۱۹، الایزا