بررسی تاثیر تیمار با داروی شیمی درمانی تموزولوماید بر روی بیان مولکول های ایمیون چک پوینت مهاری در سلول های دندریتیک مشتق از مونوسیت پالس شده با لیزات تومور گلیوبلاستوما

Abstract

ایمیون چک پوینت های مهاری از روش های تعدیل سیستم ایمنی هستند. برخی سلول های سرطانی، از طریق افزایش تولید این ایمیون چک پوینت ها، قدرت سلول های ایمنی و لنفوسیت های T را در از بین بردن سلول های توموری کم می کنند. توموزولوماید (TMZ) از درمان های خط اول برای درمان گلیوبلاستوم تازه تشخیص داده شده به حساب می آید. هدف از انجام این مطالعه بررسی تاثیر و نقش داروی تموزولوماید در فعال سازی یا مهار کردن دندریتیک سل ها و همچنین میزان بیان ایمیون چک پوینت هاست، تا در صورت امکان، بتوان از این دارو در روش های ایمنوتراپی استفاده کرد و آن را بعنوان درمانی جدید، کم عارضه و موثر در نظر گرفت. روش‌ها: ابتدا سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PBMCs) با استفاده از محلول فایکول جدا شد. سپس مونوسیت‌‌ها از طریق خاصیت چسبندگی خود به سطوح پلی استایرن از PBMC جدا شده و با استفاده از لیزات تومور گلیوبلاستوما وسایتوکاین‌های IL-4 و GM-CSF ، DCهای مشتق از مونوسیت تولید گردید. تمایز، بلوغ و فعال شدن سلول‌های دندریتیک با فلوسایتومتری سنجیده شد. برای بررسی DCها، علاوه بر بررسی مورفولوژیک این سلول‌ها حین تمایز در طی فرایند کشت سلولی به وسیله تصاویر گرفته شده با میکروسکوپ نوری ، از ارزیابی بیان مارکر‌های سطحی مختلف بیان شده روی این سلول‌ها نیز استفاده شد. بیان مارکر‌هایی همچون CD11c، HLA-DR، CD86 و CD40، با استفاده از آنتی‌بادی‌های anti-CD11c-FITC، anti-HLA-DR-APC، anti-CD86- PerCP-cy5.5 و anti-CD40-CF-blue توسط فلوسایتومتری انجام شد. بعد از مشخص کردن فنوتیپ ، DCها با LPS انکوبه شدند تا بالغ و فعال شوند. برای بدست آوردن بهترین دوز مصرفی برای داروی تموزولوماید، دوزهای مختلف (50 و 500 و 1000 میکرومولار) مورد بررسی قرار گرفت. سپس برای بررسی میزان آپوپتوز و نکروز القایی توسط دوزهای مختلف استفاده شده، به ترتیب از آنکسین و PI استفاده شده و خوانش توسط فلوسایتومتری صورت گرفت. در نهایت برای سنجش تاثیر mDC بر عملکرد داروی تموزولوماید، mDC ها با داروی تموزولوماید تیمار داده ‌شدند و بیان نسبی ژن‌های PD-L1، CTLA-4 ، LAG3 TIM3, ، BTLA و VISTA با روش Real Time PCR بدست آمد. نتایج: نتایج بدست آمده از فلوسایتومتری بیان مارکر‌های سطحی CD11c، HLA-DR، CD86 و CD40، روی سلول ها نشان داد که سلول های DC بخوبی از مونوسیت ها مشتق شدند. همچنین با توجه به نتایج فلوسایتومتری آپوپتوز و نکروز کبدی بهترین دوز موثر داروی تموزولوماید بروی mDC حدود 500 میکرومولار تعیین گردید. میزان بیان ژن های PD-L1، CTLA-4 ، LAG3 TIM3, ، و VISTA در گروه TMZ-mDC نسبت به گروه mDC به صورت قابل ملاحظه‌ای کاهش یافته است. درحالی که میزان بیان ژن BTLA در گروه TMZ-mDC نسبت به گروه mDC تغییر قابل ملاحظه‌ای نداشت.