ارزیابی اثر اگزوزوم لود شده با microRNA-365 بر مسیر سیگنالینگ NRF2\Keap1 در کارسینوم هپاتوسلولار(HCC)

Abstract

مهار حفاظت سلولی (cytoprotection)را می¬توان به¬عنوان یک استراتژی درمانی امیدوارکننده برای سرطان در نظر گرفت. از طرفی مطالعات نشان داده¬اند که تغییرات سطح miRNA ممکن است بر حفاظت سلولی ذکر شده در سلول های سرطانی تأثیربگذارد. اگزوزوم یک ناقل بیولوژیک است که به¬عنوان یک حامل موثر در انتقال ژن تایید شده است. هدف این مطالعه تعیین اینکه آیا بازیابی سطح miR-365a-3p که در اگزوزوم مشتق از HEK293 لود شده است، عملکرد ضد تومور در برابر کارسینوم سلولی کبدی (HepG2) را دارد و اثر آن بر مسیر NRF2/Keap1 چیست، طراحی شده است. روش¬ها پس از جداسازی اگزوزوم ها از HEK293، شناسایی آنها با استفاده از DLS، SEM، TEM و وسترن بلات انجام شد.miR-365a-3pدرون اگزوزوم ها بارگذاری شده و به سلول هایHepG2 انتقال یافت.سپس اثر این تیمار بر روی سطوح ROS، پروتئینهای, SOD, HO-1 NRF2, و mRNA Bcl2 داخل سلولی مورد بررسی قرار گرفت.علاوه بر این، تأثیرExomiR-365a-3p بر آپوپتوز، چرخه سلولی، و مهاجرت سلول‌هایHepG2 به ترتیب با کیتAnnexin V، رنگ‌آمیزیPI، تست خراش و سنجش سطح بیان پروتئین ADAM10مورد مطالعه قرار گرفت. یافته¬ها اگزوزوم¬های مشتق از HEK293 مورفولوژی کروی شکل و سایز 50-80 نانومتر دارند و میانگین غلظت پروتئین آن¬ها 8/1میلی¬گرم/¬ میلی¬لیتر بود. راندمان لود شدن miR-365a در اگزوزوم ها 81.3 درصد بوده و میزان ترانسفکشن ExomiR-365a-3p به داخل سلول¬های HepG2 حدود 80% می¬باشد.کاهش سطح پروتئینNRF2 به¬صورت معکوس باعث افزایش سطح ROSشده و بعلاوه بیان سایر پروتئینهای مسیر NRF2/Keap1 از جمله SOD,HO-1 کاهش یافت در جمعیت قابل¬توجهی از سلول¬های تیمار شده با ExomiR-365a-3p، رونوشت Bcl2 به¬شدت کاهش یافته که این همراه با افزایش چشمگیر آپوپتوز و وقفه چرخه سلولی است(p<0.05).علاوه بر این میزان مهاجرت و تهاجم سلول¬های سرطانی به دلیل کاهش سطح پروتئین ADAM10 کاهش میابد. (p<0.05) نتیجه¬گیری ترانسفکشن miR-365a-3p به¬واسطه Exosome می¬تواند سبب افزایش آسیب اکسیداتیو، سمیت سلولی و مرگ سلول¬های HepG2 با واسطه مسیر NRF2/Keap1 میشود.