بررسی احتمال حضور و ارتباط بین نتایج تست اندوتوکسین و تست اندازه گیری باقیماندهDNA به روش Real-Time PCR در نمونه های آب مقطر استریل تزریقی

Abstract

مقدمه: در جریان تولید Sterile Water for injection (SWFI) ، احتمال آلودگی با مواد پیروژن همانند اندوتوکسین وجود دارد. مطابق قوانین FDA مقدار اندوتوکسین مجاز در داروهای تزریقی باید کمتر از 0.25 IU باشد. تست استاندارد برای ارزیابی اندوتوکسین تستLAL می باشد. از آنجا که در باکتری های گرم منفی همانند E. Coli محتوای DNA ژنومی به دیواره باکتری متصل می باشد، سنجش آن به کمک روش Real-Time PCR (RT-PCR) احتمالاً می تواند بیانگر حضور اندوتوکسین موجود در دیواره باکتری E. Coli در نمونه های تزریقی باشد. هدف: بررسی احتمال حضور و ارتباط بین نتایج تست اندوتوکسین و تست اندازه گیری باقیمانده DNA به روش RT-PCR در نمونه های SWFI به عنوان روش پیشنهادی جایگزین برای بررسی میزان اندوتوکسین می باشد. روش کار: ابتدا پرایمر های اختصاصی برای 16SrRNA E. Coli طراحی گردید. سپس دو نمونه از SWFI کارخانه های داخل کشور به عنوان نمونه مورد ارزیابی قرار گرفت. در راستای تهیه نمونه های استاندارد بعد از استخراج DNA E. Coli؛ و تهیه رقت های متوالی آن، تست RT-PCR بر روی آنها صورت گرفت. در راستای ایجاد کنترل مثبت اندوتوکسین غلظت های مختلف از باکتری E. Coli در فرایند اتوکلاو متلاشی گردید، و تست های RT-PCR و LAL جهت بررسی میزان اندوتوکسین انجام پذیرفت. یافته ها: نتایج نشان داد که روش RT-PCR، قادر به تعیین مقدار 0.984 ng/mL از DNA معادل CFU/mL 104 ، و تست LAL قادر به شناسایی اندوتوکسین معادل 103 CFU/mL در نمونه های کنترل مثبت از باکتری E. Coli می باشد. نتیجه گیری: نتایج نشان داد علی رغم وجود همبستگی مابین نتایج RT-PCR و تست LAL، تست LAL حساسیت بیشتری در مقایسه با روش RT-PCR در تعیین مقدار اندوتوکسین در نمونه SWFI را دارد.