تولید، تعیین خصوصیات و اثرات بیولوژیک آنزیم نوترکیب ال-گلوتامیناز بر ALL

Abstract

مقدمه: لوسمی لنفوبلاستی حاد شایع ترین نوع لوسمی در میان کودکان است. یکی از عناصر اصلی رژیمهای درمانی آن آنزیم آسپاراژیناز است. با توجه به ارزش درمانی این آنزیم، نیاز مبرمی برای یافتن یک جایگزین در شرایط عدم امکان ادامه درمان احساس میشود. گلوتامیناز آنزیم تجزیه کننده گلوتامین است که به نوبه خود موجب مرگ سلولهای توموری میشود. اهداف طرح: اهداف طرح تولید نوترکیب گلوتامیناز از یک سویه بومی باکتری، تعیین ویژگی و مطالعه اثرات ضد لوسمی آن هستند. روش انجام: در این پژوهش ژن گلوتامیناز باکتری Bacillus licheniformis-SL-1 کلون شده و نتایج آن بوسیله ژل-الکتروفورز و تعیین-توالی آنالیز شدند. گلوتامیناز در Escherichia coli بیان شده سپس توسط شوک حرارتی و سونیکاسیون استخراج و با کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شد. پیش بینی ساختار و فعالیت آنزیم با مدل بندی سه-بعدی و docking مولکولی صورت گرفت. گلوتامیناز توسط SDS-PAGE، آزمون برادفورد و تست هیدرولیز آنزیمی نسلر تعیین ویژگی شد. در نهایت اثر ضد لوسمی آن با تست MTT و Annexin-V سنجیده شد. نتایج، بحث و بررسی: نتایج ژل-الکتروفورز صحت کلونینگ یک ژن bp1000 را تایید نمود، همچنین تعیین-توالی نشان داد که 99% شباهت میان ژن این باکتری و سویه استاندارد هست. مدل بندی سه-بعدی پیش بینی نمود که تنها زنجیره های پلی هیستیدینی N-ترمینال در سطح ظاهر شوند. نتایج ژل SDS-PAGE نشان داد که بیان، استخراج و خالص سازی پروتئینی به وزن تقریبی KDa 36 به درستی اتفاق افتاده. نتایج docking مولکولی پیش بینی کرد، تمایل گلوتامیناز به آسپاراژین بیشتر از گلوتامین باشد که با تست فعالیت آنزیمی تایید شد. همچنین از نتایج این تست Km= 39.83 μM و Kcat=19.85 S-1 حاصل شد. در پایان، تستهای سلولی، IC50 حدود μg/ml 30 و القای آپوپتوز بیشتر از 45% را نشان میدهند. نتیجه گیری: گلوتامیناز خالص/فعال با موفقیت تولید شد و میتوان از فعالیت ضد-لوسمی قابل قبول آن نتیجه گرفت که در صورت موفقیت در آزمایشات حیوانی میتواند جایگزینی برای آسپاراژیناز باشد.