بررسی اثر RNA کوچک مداخله گر (siRNA) ضد CD133 بر القای آپوپتوز ، مهار رشد و مهاجرت سلولهای سرطانی پروستات

Abstract

هدف از این مطالعه سرکوب بیان ژن CD133 بوسیله RNA کوچک مداخله گر (siRNA) و بررسی اثرات آن به تنهایی و همچنین ترکیب این روش با داروی پکی تاکسل بر میزان رشد سلولی، آپوپتوز سلولی، مهاجرت و ویژگیهای خودنوسازی در رده LNCaP است.مواد و روش¬ها: برای اندازه¬گیری بیان CD133 در سلول¬های سرطانی پروستات (LNCaP) از qRT-PCR استفاده شد. اثرات کشندگی CD133 siRNA ، پکلی تاکسل به تنهایی و ترکیبی از CD133 siRNA/ پکلی تاکسل با استفاده از آزمون MTT تعیین شد و برای محاسبه CDI از فرمول CDI=SAB /(SA×SB) استفاده شد. برای تعیین اثر CD133 siRNA و داروی Paclitaxel در توانایی مهاجرت سلول های LNCaP از تست خراش (wound healing assay) استفاده شد. سپس به منظور بررسی اثرCD133 siRNA و داروی Paclitaxel به تنهایی و ترکیبی از CD133 siRNA/ پکلی تاکسل بر روی خواص استم سلی در سلول های LNCaP از تستهای ,colony formation spheroied assay و cell cycle استفاده شد. علاوه بر این، از روش Flow cytometry و رنگ آمیزی 4′,6‐diamidino‐2‐phenylindole برای بررسی اثر آپوپتوز استفاده شد. سطح بیان mRNA ژن هایCD133, PTEN, AKT, mTor, C-myc, vimentine, E-cadherin و MMP-9 از طریق qRT-PCR اندازه¬گیری شد. میزان سرکوب بیان CD133 در سطح پروتئین از طریق وسترن بلات اندازه گیری شد. یافته ها : در سلول های LNCaP به دنبال ترانسفکت CD133 siRNA بیان ژن CD133 به صورت وابسته به دوز و بعد از مدت 48 ساعت کاهش یافت. تست MTT نشان داد که ترکیب CD133 siRNA/پکلی تاکسل میزان بقای سلولهای را به صورت معنی¬داری کاهش می¬دهد ومیزان IC50 ترکیب CD133 siRNA/پکلی تاکسل نسبت به IC50 دارو به تنهایی کاهش می¬یابد. نتایج بدست امده از آزمایش FCM نشان داد که CD133 siRNA بر میزان آپوپتوز ناشی از دارو را به میزان کمی القا می¬کند. تست خراش (wound healing assay) نشان داد که استفاده¬ی ترکیبی از داروی paclitaxel و CD133 siRNA مهاجرت سلول¬های سرطانی پروستات مهار می¬کند. علاوه بر این نتایج همچنین نشان داد ترکیب paclitaxel و CD133 siRNA بیان ژن هایMMP-9, m-TOR, C-myc, vimentine و AKT را کاهش می¬دهد، درحالیکه E-cadherin و PTEN را افزایش دهد.