تعیین میزان بیان ژ ن talin2؛MMP-2 , mir-106b, mir-194, در رده سلولی MDA-MB-231 بعد از تیمار با DHA

Abstract

MiRNA ها RNA های کوچک غیر کد کننده هستند که نقش مهمی در انواع سرطان ها از جمله سرطان سینه ایفا می کنند. این مولکول ها به دو دسته ی انواع القا کننده ی توموری و سرکوب کننده ی توموری تقسیم می شوند. miR-106b و miR-194 به ترتیب جز القا کننده ی توموری (انکومیر) و سرکوب کننده ی توموری در سرطان سینه هستند. در مطالعه حاضر تاثیر داروی DHA بر بیان دو miRNA در رده ی سلولی MDA-MB-231مربوط به سرطان سینه در دو شرایط نورموکسی و هایپوکسی مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش ها: رده سلولی MDA-MB-231 در محیط کشت RPMI1640 حاوی 10% FBS برای غلظت بهینه DHA کشت داده شد. به این صورت که در پلیت های 96 خانه ایی، در چاهک های مختلف تعداد سلول مشخصی را با غلظت های مختلف از DHA مجاور و بعد از 24 ساعت انکوباسیون محلول رویی خارج شد. بعد از 4 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد و بر اساس رنگ تولید شده و سنجش آن توسط دستگاه الایزاریدر در طول موج nm570، نتیجه گزارش ‌شد. و پس از استخراج RNAو سنتز ،cDNAدر نهایت میزان بیان microRNAها و نیز mRNAهای هدف آنها در دو گروه غیر تیمار شده و تیمار شده با استفاده از تکنیک Quantitative Real-time PCRاندازه گیری شد.همچنین برای تعیین میزان پروتئین مورد نظر نیز سلولهای MDA-MB-231 تیمار شده و سلولهای تیمار نشده با DHA برداشته شده و پس از شستشو ؛ و به منظور لیز سلول ها بافر RIPA اضافه شد. غلظت پروتئین محلول لیزات سلولی با استفاده از کیت BCD تعیین شد و به مقدار مساوی از آن ها با روش SDS-PAGE الکتروفورز شدند. پروتئین های جدا شده؛ سپس بر روی غشا PVDF انتقال یافته و سطوح آزاد غشا با استفاده از بافر بلاکینگ پوشانده شد. سپس آنتی بادی منوکلونال موشی اختصاصی پروتئین مورد بررسی؛ اضافه شد و پس از انکوباسیون و شستشو؛ آنتی بادی کونژوگه باHRP ضد آنتی بادی موشی اضافه شد .وجود باند های اختصاصی در انتها با افزودن محلول کیتELC و درزیر دستگاه تصویر برداری مشخص شد. از وجود باند بتا اکتین به عنوان کنترل استفاده شد. یافته ها: نتایج این مطالعه در رده سلولی MDA-MB-231 پس از تیمار سلول ها با DHA میزان بیان MMP-2, MMP-9, vimentin کاهش و میزان بیان پروتئین talin2 افزایش یافت هم چنین باعث افزایش بیان miR-194 و کاهش بیان miR-106b شد.