ساخت وکتوربیان کننده پروکاریوتیکی برایاینترلوکین 4،کلونینگ وبیان آن درباکتری اشرشیاکلی

Abstract

اینترلوکین 4موشی ازلنفوسیتهای T فعال ،ماست سل ها وبازوفیل ها ترشح می شود،کهرشد وتمایز طیف وسیعی از سلول های هماتوپویتیک وغیرهماتوپویتیک شامل سیستم ایمنی بخصوص لنفوسیتهای Tو Bمنوسیتهای ،ماکروفاژها، میلویید، فیبربلاستها و سلولهای اندوتلیال را تنظیم می کند.این ماده سایتوکاین اصلی در سویچ کلاس زنجیره سنگین ،بخصوص در شیفت ایمنی هومورال درجهت تحریک IgEازسلولهای B وتنظیم تولید آنتی بادی می باشد.درضمن نشان داده شده که اینترلوکین 4دارای اثر ضدتوموری درInvitorوInvivo بوده ونقش موثری در دفاع با واسطه گری ائوزینوفیل ها در برابرعفونتهای کرمی وانگلی دارند.به دلیل برخی محدودیتها دربدست آوردن پروتئین مورد نظراز منابع طبیعی ازجمله تولید زودگذر،سختی استخراج آن، هزینه بالا واز طرفی برخی مزایای تو لید در سلولهای پروکاریوت، میل درجهت کلون نمودن ژن کدکننده اینترلوکین 4را دریک حامل مناسب درسلولهای پروکاریوت برمی انگیزد که در تحقیق حاضر توانستیم به هدف مزبور نائل آئیم.برای این منظور پلاسمیدPWZLmIL4B7.1 به عنوان الگو درراستای تکثیر ژن مورد نظرباروش PCRو (+)pET21a به عنوان حامل ،انتخاب گشت .سپس اینترلوکین 4داخل حامل بیان کننده (+)PET21a واردشده وپلاسمیدنوترکیب درباکتری E.coli گونهDH5_a کلون وتکثیرگردید.پس ازتاییدنتایج کلون کردن به روش هضم آنزیمی ،پلاسمیدها استخراج وبرای بیان داخل سلولهای BL21 ترانسفورمی گردد.درنتیجه پلاسمیدنوترکیبی به نام PETmIL_4 که قابلیت بیان ژن اینترلوکین 4راتحت کنترل پروموتور قوی T7دارد،ساخته شد.آنالیزمولکولی ساختار حاصله باروش PCRوبرش آنزیمی انجام گرفت.نتایج نشان دادکه این پلاسمید ساخته شده واجد cDNA کدکننده mIL_4 می باشد.پس از تائید صحت همسانه سازی وتعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات همسان شده، بیان سیتوپلاسمی اینترلوکین 4نوترکیب تحت القا IPTGدرسویه BL21 از باکتری اشرشیاکلی بررسی شد.بررسی بیان ژنmIL_4 با استفادهازتکنیک SDS_PAGE انجام گردید.درنهایت نتیجه گیری گردیدکه با ساخت پلاسمیدنوترکیب PETmIL_4 که توانایی بیان IL_4رادرسلولهای اشرشیاکلی داشته و تهیه سلولهای تراریخته بیان کننده اینترلوکین4،زمینه مناسب برای مطالعات بعدی به منظور تولید بهینه پروتئین نوترکیب فراهم می باشد.