ساخت و تایید سلول نوترکیب HEK-293 با بیان بالای TIM-1

Abstract

مولکولTIM-1 (T cell immunoglobulin mucin-1) یک گلیکوپروتئین غشایی است که بر سطح سلول های T-helper2 بیان می شود و نقش مولکول کمک تحریکی را بازی می کند. مولکول TIM-1در تنظیم پاسخ سیستم ایمنی به بیماری های خود ایمنی، آلرژی و عفونی به ویژه ویروسی، نقش ویژه ای دارد. بر اساس مطالعات اخیر، هدف گیری مولکول TIM-1 می تواند یک روش درمانی برای بیماری های ذکر شده باشد. هدف از این مطالعه، کلون و بیان پروتئین TIM-1 بر سطح سل لاین HEK-293 به منظور تهیه TIM-1 cell display مورد نیاز در پروسه SELEX برای انتخاب اپتامر اختصاصی TIM-1 است. مواد و روش ها: پس از استخراج RNA از سلول های تک هسته ای خون محیطی، cDNA سنتز و به وسیله PCR همراه پرایمرهای اختصاصی، قطعه TIM-1 تکثیر یافت. محصول PCR در پلاسمیدpcDNATM3.1/Hygro (+) ، کلون و در باکتری Escherichia coli TOP 10 F' ترانسفورم شد. سپس محصول کلونینگ تعیین توالی گردید. پلاسمید نوترکیب حاصل، پس از خطی شدن به سلول HEK-293 ترانسفکت شد. نهایتاً، بیان پروتئین TIM-1در سطح سلول، توسط فلوسایتومتری ارزیابی گردید.یافته ها: نتیجه توالی یابی، صحت توالی TIM-1 را تایید کرد. الکتروفورز محصول PCR، حضور پلاسمید نوترکیب را در DNA ژنومیک سلول ثابت کرد. نتایج فلوسایتومتری نشان داد که پروتئین TIM-1 تقریباً در سطح 15/88 درصد سلول های HEK-293 ترانسفکت شده، بیان می شود., 1 (T-cell immunoglobulin mucin 1) is a membrane glycoprotein which expresses on T helper2 cells and plays a co-stimulatory role. TIM-1 has important roles in regulation of autoimmune and allergic diseases, as well as in response to viral infections. According to the recent studies, targeting TIM-1 could be a potential therapeutic approach against such diseases. In this study, we aimed to express TIM-1 protein on Human Embryonic kidney (HEK) 293T cell line in order to preparation of the TIM-1 cell display in SELEX process for selection of specific aptamer.Materials and Methods: The cDNA was synthesized after RNA extraction from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and TIM-1 cDNA was amplified by PCR with specific primers. The PCR product was cloned in pcDNA™3.1/Hygro (+) and transformed in Escherichia coli TOP 10 F'. After cloning, authenticity of DNA sequence was checked and expressed in HEK 293T cells. Finally, expression of TIM-1 was analyzed by flow cytometry.Results: The result of DNA sequencing demonstrated correctness of TIM-1 DNA sequence. Agarose gel electrophoresis of PCR product demonstrated the presence of the recombinant plasmid in genomic DNA. The flow cytometry results indicated that TIM-1 was expressed in about 90% of transfected HEK 293T cells