جداسازی قطعات scFv آنتی بادی علیه کیرنده ی فاکتور رشد شبه انسولین یک (IGF1R) از کتابخانه ی آنتی بادی فاژی وبررسی عملکرد آن

Abstract

گیرندهی فاکتور رشد شبه انسولین یک (IGF-IR) بر روی سلول‌های سرطانی سینه بیان شده و در متاستاز، بقا و تکثیر سلول‌های سرطانی نقش دارد. استفاده از مونوکلونال آنتیبادیهایی که IGF-IR را مورد هدف قرار میدهند به صورت تنها یا در ترکیب با سایر داروها، یک روش امید بخش برای درمان سرطان سینه معرفی شده است. قطعات کوچک نواحی متغییر آنتیبادی (scFv : Single-chain fragment variable) به خاطر مزیت‌‌های فراوانی که نسبت به آنتیبادیهای کامل دارند به عنوان ابزار مناسبی برای هدف قرار دادن سلول‌های توموری معرفی شده‌اند.مواد و روش¬ها: در این مطالعه، ما یک کتابخانه آنتیبادی فاژی غیر ایمیون (naïve phage library) را مورد استفاده قرار دادیم و با استفاده از تکنیک پنینگ (panning) scFvهای اختصاصی بر علیه یک اپیتوپ از دُمِین خارج سلولی IGF-IR را جداسازی کردیم. اختصاصیت‌ scFvهای جداسازی شده را با استفاده از روش‌های مختلفی از جمله پلیکلونال الایزا، مونوکلونال الایزا، الایزای فاز محلول، کلونی پیسیآر (Colony PCR) و سکانس کردن ژن (sequencing) مورد بررسی قرار دادیم و در نهایت اثرات ضد تکثیری و آپوپتوزی scFvهای جداسازی شده را به روش MTT و Annexin V/PI بررسی کردیم.یافته‌ها: نتایج الایزا اختصاصیت scFvهای جداسازی شده نسبت به پپتید IGF-IR را تایید کرد و با آنالیز محصول پیسیآر (PCR product) و سکانس ژن مشخص شد که ژن جداسازی شده مربوط به مناطق متغییر زنجیره‌های سبک و سنگین (VH and V) میباشد. تیمار سلول‌های MCF7 و SKBR3 با scFvهای اختصاصی IGF-IR، رشد سلول‌ها را به صورت قابل توجهی مهار کرد. همچنین نتایج ما نشان داد که تیمار با scFv به صورت قابل توجهی تاثیرات مهاری trastuzumab بر روی سلول‌های SKBR3 را افزایش میدهد. میزان آپوپتوز سلول‌های MCF7 و SKBR3 بعد از 24 ساعت تیمار با scFv به ترتیب 29/37 درصد و 21/31 درصد بود. 24 ساعت تیمار با scFv در ترکیب با trastuzumab منجر به 29/42 درصد آپوپتوز در سلول‌های SKBR3 شد., Insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) is expressed on breast cancer cells and involves in metastasis, survival, and proliferation. Currently, application of IGF-IR-targeting monoclonal antibodies (mAbs), alone or in combination with other drugs, is a promising strategy for breast cancer therapy. Single-chain fragment variable (scFv) antibodies have been introduced as appropriate tools for tumor-targeting purposes because of their advantages over whole antibodies. Material and Methods: In the present study, we employed a naïve phage library and isolated scFvs against a specific epitope from extracellular domain of IGF-IR by panning process. The selected scFvs were further characterized using polyclonal and monoclonal phage ELISA, soluble monoclonal ELISA, colony PCR and sequencing. Antiproliferative and apoptotic effects of selected scFv antibodies on breast cancer cell lines were also evaluated by MTT and Annexin V/PI assays. Results: The results of ELISA indicated specific reactions of the isolated scFvs against the IGF-IR peptide and analyses of PCR product and sequencing confirmed the presence of full length VH and V inserts. Treatment of MCF7 and SKBR3 cells with anti-IGF-IR scFv led to significant growth inhibition. The results also showed that scFv treatment significantly augmented trastuzumab growth inhibitory effects in SKBR3 cells. The percentage of the apoptotic MCF7 and SKBR3 cells after 24 h treatment with scFv was 37.29 % and 31.21 % respectively. 24 h treatment with scFv in combination with trastuzumab resulted in 42.29 % apoptosis of SKBR3 cells.